二羥基鐵-肝素納米顆粒-VEGF修飾促進(jìn)去細(xì)胞血管基質(zhì)生物相容性和內(nèi)皮化的研究.pdf

1、第一章二羥基鐵/肝素復(fù)合物納米修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)的制備和生物相容性評(píng)價(jià)
　　目的:去細(xì)胞異種血管植入體內(nèi)存在血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在采用二羥基鐵/肝素復(fù)合物(DHCs)修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)以提高其生物相容性。評(píng)估其作為一種新型肝素修飾去細(xì)胞異種血管方法的可行性。
　　方法:使用二羥基鐵作為交聯(lián)劑，采用層層自組裝技術(shù)將二羥基鐵(DHI)和肝素交替固定在BJV表面，構(gòu)建一種新型的DHCs抗凝表面。通過(guò)甲苯胺藍(lán)比色法檢測(cè)剩余肝素濃

2、度而獲得每次自組裝結(jié)合肝素的量;掃描電鏡(SEM)和組織切片甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)肝素和二羥基鐵層層自組裝修飾BJV(LBL-BJV)的表面微結(jié)構(gòu);拉力試驗(yàn)檢測(cè)其生物力學(xué)性能;洗脫試驗(yàn)檢測(cè)DHCs與BJV結(jié)合的穩(wěn)定性;抗凝血活性檢測(cè)、血小板粘附實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和抗鈣化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBL-BJV的生物相容性。
　　結(jié)果:甲苯胺藍(lán)比色法顯示每組裝一次約有808±86μg/cm2肝素固定在BJV表面;掃描電鏡顯示DHCs是均勻的包裹在膠原纖

3、維表面并形成納米膜;甲苯胺藍(lán)組織切片染色提示肝素主要結(jié)合在BJV的表面;拉力試驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組的生物力學(xué)穩(wěn)定性顯著地提高;洗脫試驗(yàn)提示DHCs穩(wěn)定地結(jié)合在BJV的表面并持續(xù)緩慢的釋放肝素;抗凝血活性檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組PT和APTT明顯高于正常值范圍;實(shí)驗(yàn)組材料表面的血小板數(shù)明顯低于對(duì)照組，每10000μm2 LBL-BJV和DC-BJV表面血小板計(jì)數(shù)分別為8±4和48±16;內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)過(guò)7天的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料表面內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)相

4、似;在皮下包埋4周時(shí)，LBL-BJV和DC-BJV中鈣離子的含量分別為8.5±1.9μg/mg和26.6±3.7μg/mg;8周時(shí)，LBL-BJV和DC-BJV中鈣離子的含量分別為21.5±6.8μg/mg和112.6±16.9μg/mg。
　　結(jié)論: DHCs牢固地結(jié)合在DC-BJV表面，形成抗凝表面，并長(zhǎng)時(shí)間的緩慢釋放肝素。DHCs納米修飾能夠提高去細(xì)胞血管基質(zhì)的生物力學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性。
　　第二章二羥基鐵/低分子肝

5、素納米顆粒的制備與性能評(píng)價(jià)
　　目的:低分子肝素鈉(LMWH)的半衰期短，維持抗血栓活性時(shí)間短。本研究旨在制備一種具有抗凝血活性的、能緩釋LMWH的DHI/LMWH納米顆粒(DLN)，并評(píng)估其作為一種新型抗凝血藥物的可能性。
　　方法:在超聲振蕩或磁力攪拌條件下，將DHI溶液加入LMWH溶液而形成DLN溶液;并將兩種方法在不同的DHI/LMWH質(zhì)量比條件下，檢測(cè)兩種條件下形成的納米顆粒形狀、粒徑、zeta電位和包封率;紅外吸

6、收光譜檢測(cè)DLN與LMWH兩者的紅外吸收光譜的差異。
　　結(jié)果:在超聲振蕩條件下形成的納米顆粒平均粒徑小于100 nm，而在磁力攪拌條件下形成的納米顆粒平均粒徑大于100 nm;兩種處理方法對(duì)納米顆粒的zeta電位和包封率都沒(méi)有影響:zeta電位均為負(fù)值;包封率與DHI/LMWH的質(zhì)量比呈正相關(guān);當(dāng)DHI/LMWH質(zhì)量比低于1.2時(shí)，形成納米顆粒的平均粒徑低于100 nm，當(dāng)DHI/LMWH的質(zhì)量比大于1.2時(shí)，形成的納米顆粒的粒

7、徑超過(guò)100 nm，并出現(xiàn)微米級(jí)顆粒;SEM圖片顯示DLN呈矩形晶體狀結(jié)構(gòu);DLN與LMWH的紅外吸收光譜大體相似，但DLN的紅外吸收光譜中出現(xiàn)1732 cm-、1549 cm-、690cm-、423cm-四處吸收峰;DLN在PBS中穩(wěn)定存在并緩慢釋放:第一天釋放量稍大，約占總量的5.1％，其后是均勻釋放，經(jīng)4周的震蕩，LMWH的釋放量約占總量的43.8％。
　　結(jié)論:DHI和LMWH能夠在超聲振蕩條件下形成具有緩釋功能的抗凝納米

8、顆粒，DLN有望成為一種新型的納米抗凝藥物。
　　第三章二羥基鐵/低分子肝素納米顆粒-VEGF修飾促進(jìn)去細(xì)胞血管基質(zhì)的生物相容性和內(nèi)皮化的研究
　　目的:異種移植血管存在生物相容性差和血管內(nèi)皮化不足等缺陷，為了促進(jìn)去細(xì)胞血管基質(zhì)的生物相容性和內(nèi)皮化，采用DLN-VEGF修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)表面，評(píng)估其作為一種修飾去細(xì)胞異種血管方法的可行性。
　　方法:先使用DHI和LMWH預(yù)處理去細(xì)胞牛頸靜脈(DC-BJV)，通過(guò)DHI

9、和LMWH之間作用力將DLN固定到去細(xì)胞血管基質(zhì)的表面，再通過(guò)LMWH將VEGF固定到去細(xì)胞血管基質(zhì)的表面，構(gòu)建一種二羥基鐵/低分子肝素納米顆粒-VEGF修飾的去細(xì)胞牛頸靜脈(DLN-VEGF-BJV);掃描電鏡(SEM)和組織切片甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)DLN-VEGF-BJV的表面微結(jié)構(gòu);拉力試驗(yàn)檢測(cè)其生物力學(xué)性能;洗脫試驗(yàn)檢測(cè)DHI與BJV結(jié)合的穩(wěn)定性;血小板粘附實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和抗鈣化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其的生物相容性;體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢

10、測(cè)其促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增值能力。
　　結(jié)果:掃描電鏡顯示DLN廣泛分布DLN-VEGF-BJV血管基質(zhì)表面的纖維表面和纖維縫隙間;甲苯胺藍(lán)組織切片染色提示DLN主要結(jié)合在BJV材料的外表面;拉力試驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組的生物力學(xué)穩(wěn)定性有顯著性提高;免疫組化提示VEGF結(jié)合在血管基質(zhì)的表面;釋放試驗(yàn)提示LMWH和VEGF能夠緩慢的從其表面釋放;并具有抗抗血小板粘附，每10000μm2 DLN-VEGF-BJV和DC-BJV表面的血小板計(jì)數(shù)分別為

11、12±4和48±16;內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)過(guò)3天和7天的培養(yǎng)，DLN-VEGF-BJV表面內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯大于DC-BJV表面內(nèi)皮細(xì)胞數(shù);皮下包埋4周時(shí)，DLN-VEGF-BJV和DC-BJV鈣離子的含量分別為8.1±1.7μg/mg和26.6±3.7μg/mg;8周時(shí)，DLN-VEGF-BJV和DC-BJV鈣離子的含量分別為23.5±6.1μg/mg和112.6±16.9μg/mg。
　　結(jié)論:DLN能夠被穩(wěn)定地修飾在去細(xì)胞