cAMP在小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動(dòng)物模型免疫逃逸過(guò)程中的作用研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是來(lái)源于B、T淋巴細(xì)胞的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，在NHL發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，淋巴瘤細(xì)胞通過(guò)多種免疫機(jī)制以逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)在淋巴瘤的免疫逃逸和免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。許多研究致力于減少Tregs數(shù)量及/或功能，提高效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells，Teff)的功能，從而阻斷淋巴瘤免疫耐受形成的

2、關(guān)鍵通路，期望對(duì)NHL免疫療法起到關(guān)鍵性的輔助作用。Bopp T等的研究發(fā)現(xiàn)Tregs可以通過(guò)細(xì)胞間的縫隙連接將環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)轉(zhuǎn)運(yùn)至Teff胞內(nèi)，從而提高了Teff細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，抑制了白介素2的合成。提示免疫細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量與Tregs介導(dǎo)的免疫逃逸過(guò)程有著密切關(guān)系。
　　 近年來(lái)研究證實(shí)，小劑量環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)在腫

3、瘤及自身免疫病的治療中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CY是細(xì)胞毒類(lèi)烷化劑，廣泛應(yīng)用于淋巴瘤化療中，但是尚無(wú)小劑量環(huán)磷酰胺在淋巴瘤動(dòng)物模型中免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究。本研究中我們將小劑量CY應(yīng)用于NHL動(dòng)物模型中，探討了CY對(duì)Tregs細(xì)胞的作用機(jī)制。本研究為創(chuàng)新性研究。
　　 在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)展的過(guò)程中涉及多種信號(hào)途徑，細(xì)胞是存活還是凋亡取決于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間多種信號(hào)途徑之間的平衡網(wǎng)絡(luò)。其中cAMP信號(hào)途徑在淋巴瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用日益受

4、到重視，提高淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度有助于促進(jìn)惡性淋巴細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到靶向治療的目的。
　　 本研究通過(guò)應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及免疫學(xué)技術(shù)，闡明了cAMP信號(hào)途徑在小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動(dòng)物模型中免疫逃逸過(guò)程的作用。同時(shí)對(duì)小劑量環(huán)磷酰胺和cAMP擬似物的協(xié)同作用進(jìn)行了初步探討。尋求淋巴瘤免疫治療的新方法，提高臨床治療效果。
　　 第一部分：小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動(dòng)物模型免疫逃逸過(guò)程的作用研究

5、r>　　 目的：本研究中，為了研究小劑量環(huán)磷酰胺(20mg/kg)對(duì)Tregs的抑制作用，我們選用小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株A20細(xì)胞建立侵襲性淋巴瘤小鼠模型。首先比較了治療前后各組小鼠的荷瘤生存期及腫瘤直徑變化。并進(jìn)一步制備引流淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液，通過(guò)磁珠分選，獲得純化的Tregs和Teff細(xì)胞。檢測(cè)免疫細(xì)胞的Foxp3及IL-2表達(dá)等指標(biāo)，觀察小劑量CY治療前后Tregs和效應(yīng)T細(xì)胞的功能變化。
　　 材料與方法：
　　

6、 1.細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 2.單細(xì)胞制備
　　 3.蛋白提取及蛋白印記分析
　　 4.提取RNA，進(jìn)行RT-PCR
　　 5.Tregs及效應(yīng)T細(xì)胞(Teft)的分離
　　 6.流式細(xì)胞儀分析
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 結(jié)果：
　　 1.A20細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠模型的建立(圖1)
　　 (1)小鼠B系淋巴瘤細(xì)胞株A20由中山大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)，應(yīng)用含10％滅活

7、的胎牛血清、青霉素(100U/ml)以及鏈霉素(100mg/mL)的RPMI-1640(Gibco)全培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。每2-3天傳代一次。所有實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
　　 (2)制備A20細(xì)胞懸液：在A20細(xì)胞株處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的情況下，使用不含血清的1640培養(yǎng)基洗凈細(xì)胞，離心，170g，10min，調(diào)整密度至5×107/mL。
　　 (3)選取6-8周齡BALB/c近交系小鼠，在右背部皮下

8、注射A20細(xì)胞懸液100μL。正常組以PBS溶液代替A20細(xì)胞懸液。腫瘤植入后7天，給予20mg/kg CY。
　　 2.BALB/c小鼠NHL模型的觀察
　　 對(duì)接種A20細(xì)胞的小鼠的成瘤情況進(jìn)行觀察，成瘤率為90％。
　　 皮下注射A20細(xì)胞懸液后7天、14天、21天、28天分別測(cè)量?jī)山M荷瘤小鼠的腫瘤直徑，CY治療后腫瘤直徑明顯縮小，生存期延長(zhǎng)，延緩了腫瘤發(fā)展(圖2A和B)。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

9、
　　 3.1荷瘤小鼠引流淋巴結(jié)內(nèi)CD+CD25+T細(xì)胞比值變化
　　 在荷瘤小鼠的引流淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+CD25+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例腫瘤組明顯高于正常對(duì)照組，CY治療后下降，8天達(dá)到最低點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0004)(圖3)。
　　 3.2 MACS提取CD4+CD25-T細(xì)胞，CD4+CD25+T細(xì)胞的純度測(cè)定
　　 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，使用MACS技術(shù)分離后得到的CD4+CD25-T細(xì)

10、胞純度在98％以上，CD4+CD25+T細(xì)胞純度在90％以上。
　　 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Foxp3表達(dá)
　　 Foxp3mRNA表達(dá)量在荷瘤小鼠引流淋巴結(jié)中表達(dá)高于對(duì)照組。CY治療可以明顯降低Foxp3表達(dá)，在治療8天時(shí)達(dá)到抑制最低點(diǎn)，后Foxp3表達(dá)逐漸恢復(fù)至治療前(圖4)。
　　 5.Western Blot技術(shù)檢測(cè)各類(lèi)T細(xì)胞內(nèi)FoxP3蛋白的表達(dá)
　　 MACS技術(shù)分離得到的淋巴結(jié)內(nèi)CD4

11、+CD25+T細(xì)胞，可見(jiàn)到FoxP3蛋白表達(dá)。經(jīng)小劑量CY治療后Foxp3蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間有變化。第8天最低，第14天恢復(fù)(圖5)。
　　 6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-2表達(dá)
　　 BALB/c小鼠IL-2mRNA表達(dá)量顯著高于荷瘤組。隨著CY作用時(shí)間不同，IL-2表達(dá)量顯示出先升高后降低的趨勢(shì)，CY治療第8天達(dá)到最高水平，與荷瘤小鼠比較有顯著差異(圖6)。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20 B細(xì)胞淋

12、巴瘤小鼠模型是一種良好的NHL動(dòng)物模型。
　　 2.Tregs在淋巴瘤動(dòng)物模型中高表達(dá)，與腫瘤免疫耐受相關(guān)。
　　 3.小劑量環(huán)磷酰胺可短暫下調(diào)動(dòng)物模型中Tregs比例及功能，刺激效應(yīng)T細(xì)胞功能，有望逆轉(zhuǎn)免疫耐受。
　　 4.小劑量環(huán)磷酰胺延長(zhǎng)動(dòng)物模型的荷瘤生存期，是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。
　　 第二部分：cAMP在小劑量CY抑制Tregs過(guò)程中的作用研究和cAMP擬似物對(duì)NHL細(xì)胞凋亡作用的研究

13、　　 目的：淋巴瘤小鼠模型中小劑量CY發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，在本部分，我們進(jìn)一步研究了免疫細(xì)胞內(nèi)cAMP含量在CY作用過(guò)程中的變化，以明確CY的作用機(jī)制，為cAMP信號(hào)途徑與環(huán)磷酰胺途徑的協(xié)同作用奠定理論基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞是存活還是凋亡取決于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間多種信號(hào)途徑之間的平衡網(wǎng)絡(luò)。其中cAMP信號(hào)途徑在淋巴瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用日益受到重視。本研究中，我們將臨床常用的cAMP擬似物作用于A20淋巴瘤細(xì)胞株，并研究了CY和cAMP擬似物對(duì)動(dòng)

14、物模型的腫瘤組織中磷酸化及未磷酸化AKT的變化，探討淋巴瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，從而達(dá)到靶向治療的目的。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 2.免疫細(xì)胞內(nèi)cAMP含量測(cè)定
　　 3.腫瘤組織蛋白提取及蛋白印記分析
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)A20細(xì)胞凋亡及周期阻滯
　　 5.免疫組化研究
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 結(jié)果：
　　 1.不同免疫細(xì)胞內(nèi)cA

15、MP含量變化
　　 我們檢測(cè)了小劑量CY治療前后免疫細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量變化。明確cAMP信號(hào)途徑在小劑量環(huán)磷酰胺作用過(guò)程中的重要作用。
　　 1.1CD4+CD25-T細(xì)胞內(nèi)cAMP含量變化：
　　 BALB/c小鼠Teff細(xì)胞內(nèi)較荷瘤小鼠低，CY治療4天后細(xì)胞內(nèi)cAMP含量逐漸降低，第8天降至最低，治療14天時(shí)再次升高。CY治療第8天與治療14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2 CD4+CD25

16、+T細(xì)胞內(nèi)cAMP含量變化：
　　 荷瘤小鼠較BALB/c小鼠Tregs細(xì)胞內(nèi)含量高，CY治療4天后細(xì)胞內(nèi)cAMP含量逐漸降低至第8天最低，治療14天時(shí)再次升高。CY8天與14天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。
　　 2.A20細(xì)胞株凋亡
　　 在不同濃度的cAMP擬似物誘導(dǎo)下，A20細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，周期阻滯不明顯。
　　 3.腫瘤組織中AKT磷酸化及未磷酸化形式的蛋白含量改變
　　 小劑

17、量CY對(duì)NHL動(dòng)物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒(méi)有影響。而cAMP擬似物可以抑制磷酸化AKT的表達(dá)。
　　 4.免疫組化結(jié)果
　　 小劑量CY對(duì)NHL動(dòng)物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒(méi)有影響。而cAMP擬似物可以抑制磷酸化AKT的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.cAMP擬似物誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞株凋亡。
　　 2.小劑量CY對(duì)NHL動(dòng)物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒(méi)有影響。
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