提高耐熱鏈霉菌轉(zhuǎn)化泰樂菌素能力的分子育種改造.pdf

1、乙酰異戊酰泰樂菌素(AIV)是一種高效的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，有著很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。它是通過耐熱鏈霉菌生物轉(zhuǎn)化泰樂菌素，在泰樂菌素的3-OH乙酰基化和4"-OH異戊?；@得。本研究希望通過在耐熱鏈霉菌中分別整合acyB1-B2基因、ermE基因和中斷nsdA基因三個方面的分子改造，以提高泰樂菌素轉(zhuǎn)化率。 本研究首先通過搖瓶裝量、轉(zhuǎn)種量、種齡、發(fā)酵培養(yǎng)周期4個搖瓶發(fā)酵參數(shù)的研究，初步確定了耐熱鏈霉菌搖瓶發(fā)酵的最佳工藝流程。出發(fā)菌

2、株經(jīng)二級種子培養(yǎng)24h后，以10％的轉(zhuǎn)種量，轉(zhuǎn)種到35mL發(fā)酵培養(yǎng)基，48h后補(bǔ)加泰樂菌素和亮氨酸，補(bǔ)料48h測轉(zhuǎn)化率，出發(fā)菌株泰樂菌素轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在70％。 AcyA負(fù)責(zé)乙?；δ?，acyB1-B2負(fù)責(zé)異戊酰基化功能，acyB2基因是acyB1基因的正調(diào)控基因。本研究將acyB1-B2基因單獨(dú)克隆出來，插入pIJ8600構(gòu)建成整合表達(dá)載體pBIB425，導(dǎo)入耐熱鏈霉菌工業(yè)菌株BIB0830中，得到重組菌株BIB425。HPLC

3、分析表明，與出發(fā)菌株BIB0830相比，BIB425泰樂菌素轉(zhuǎn)化率提高了14％。結(jié)果表明單獨(dú)增加acyB1基因拷貝數(shù)不足以提高耐熱鏈霉菌的異戊?；富?，acyB2基因的激活作用在整個?；^程中至關(guān)重要。 ErmE基因類似于carB基因，編碼核糖體雙甲基化酶。本研究以pIJ8600為出發(fā)菌株，構(gòu)建了ermE(ermEp*)基因的整合表達(dá)載體pBIB304。通過屬間接合轉(zhuǎn)移，整合到BIB0830中，抗性篩選和PCR驗(yàn)證得到陽性克

4、隆BIB304。結(jié)果表明重組菌株BIB304在固體平皿和液體YEME培養(yǎng)基中對泰樂菌素的耐受性均從100μg/mL提高到900μg/mL。在搖瓶水平上，導(dǎo)入紅霉素的抗性基因?qū)δ蜔徭溍咕锪亢娃D(zhuǎn)化泰樂菌素?zé)o明顯影響。 本研究還對在鏈霉菌中普遍存在的負(fù)調(diào)控基因nsdA進(jìn)行了研究。通過接合轉(zhuǎn)移nsdA基因中斷載體pBIB308，得到nsdA基因中斷突變株BIB308。HPLC結(jié)果顯示：在搖瓶水平上，BIB308的泰樂菌素轉(zhuǎn)化率提高了