腺病毒介導的淋巴細胞趨化因子對白細胞介素-10基因修飾的EG7的治療作用及其相關機制.pdf

1、研究表明惡性腫瘤生長迅速的一個重要機制是腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視。腫瘤細胞在體內(nèi)生長的同時，自身也可分泌多種抑制免疫活性的物質(zhì)，如白介素-6、白介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β，抑制免疫細胞的應答，促進腫瘤細胞的生長，逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。因此，利用細胞因子優(yōu)化腫瘤抗原提呈的微環(huán)境，解除腫瘤細胞對其周圍免疫細胞的抑制作用，活化免疫細胞的特異性抗腫瘤免疫應答功能，是抑制腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視的一個重要措施。 白介素-10(IL-

2、10)被普遍認為是一種免疫抑制性細胞因子，促使腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視，但近年對腫瘤免疫的研究方向部分傾向于IL-10的免疫刺激功能。實際上，在不同的腫瘤模型中，IL-10對天然性、適應性免疫具有正反雙重調(diào)節(jié)作用，它能使腫瘤細胞逃避機體抗腫瘤效應，亦可作為一種免疫佐劑增強機體抗腫瘤免疫應答。有研究發(fā)現(xiàn)將IL-10基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞中，局部高表達的IL-10使腫瘤細胞喪失成瘤性并增強免疫原性，從而有效地激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應，如IL-

3、10基因修飾的腫瘤細胞建造的動物模型，黑色素瘤、CT26結腸癌、乳腺腫瘤、Burkitt淋巴瘤等的致瘤性降低，抑制程度與IL-10的分泌量呈正相關，遠處轉(zhuǎn)移能力喪失，并最終引起腫瘤消除。 EG7是來源于C57BL／6的T淋巴瘤細胞EL-4穩(wěn)定表達OVA的腫瘤細胞株，將mIL-10基因轉(zhuǎn)染EG7細胞制備成穩(wěn)定表達IL-10的EG7／IL-10細胞株。C57BL／6小鼠皮下接種EG7／IL-10細胞，建立小鼠T淋巴瘤模型，使小鼠T淋

4、巴瘤局部微環(huán)境高表達IL-10，觀察小鼠體內(nèi)成瘤情況以及荷瘤小鼠的免疫功能，在先前對IL-10基因修飾腫瘤細胞研究基礎上進一步探討IL-10抗腫瘤機制，尤其是非特異性增強NK細胞殺傷活性。單獨應用一些具有抗腫瘤作用的細胞因子如IL-10、IL-12、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等進行基因治療雖然能有效地誘導抗腫瘤效應，但它們的效果比較局限，一般只能在一定程度上局部抑制腫瘤的生長，對于已經(jīng)惡性生長的腫瘤，這種單獨細胞因子基因療

5、法很難達到理想的效果。選擇相互間有協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用的細胞因子，進行聯(lián)合基因治療，是腫瘤細胞因子基因治療的一個發(fā)展方向。 實驗表明，淋巴細胞趨化因子(Lptn)可特異性趨化自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)和T細胞至腫瘤發(fā)生部位，殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。Dilloo等報道在小鼠腫瘤模型中，Lptn與IL-2聯(lián)合具有抗腫瘤活性，Lptn可吸引腫瘤局部的T細胞、NK細胞浸潤，而IL-2使T細胞

6、大量擴增。從而提高特異性的抗腫瘤免疫應答。以樹突狀細胞為基礎的疫苗，可通過提高樹突狀細胞的抗原提呈能力激發(fā)起抗原特異的細胞毒性T細胞(CTE)反應。 鑒于Lptn可有效趨化NK和T細胞，我們將聯(lián)合Ad-Lptn瘤內(nèi)注射治療轉(zhuǎn)染IL-10的EG7 T淋巴瘤。本課題主要目的是研究IL-10基因修飾的EG7 T淋巴瘤的致瘤性及對荷瘤小鼠免疫功能影響，同時通過瘤內(nèi)注射Ad-Lptn聯(lián)合治療小鼠T淋巴瘤，觀察其對小鼠T淋巴瘤的治療作用以及

7、長期免疫保護作用，為抗腫瘤治療新方法提供實驗依據(jù)。建立了穩(wěn)定表達IL-10的小鼠T淋巴瘤模型EG7，對小鼠腫瘤生長、生存期做了進一步觀察，應用Lptn的重組腺病毒進行瘤內(nèi)注射觀察其治療效果。 第一部分：IL-10基因修飾對EG7致瘤性的影響 收集對數(shù)生長期的EG7、EG7／IL-10細胞，注射至C57BL／6小鼠右大腿外側，建立T淋巴瘤模型，用游標卡尺測量腫瘤大小并觀察荷瘤小鼠的生存期，詳細記錄小鼠腫瘤生長大小、速度及健

8、康狀況。結果發(fā)現(xiàn)，與EG7對照組相比，IL-10基因修飾的EG7抑制了腫瘤的生長，延長了荷瘤小鼠的生存期。研究發(fā)現(xiàn)，高表達的IL-10增強了小鼠脾細胞的NK和CTL殺傷活性并誘導了更多的Th2型細胞因子(IL-4、IL-10)的分泌。提示機體被有效誘導產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應。 第二部分：Ad—Lptn瘤內(nèi)注射增強IL-10基因修飾的EG7的抗腫瘤作用 收集對數(shù)生長期的EG7、EG7／IL-10細胞，注射至

9、C57BL/6小鼠右大腿外側，建立T淋巴瘤模型，隨機分組后，分別瘤內(nèi)注射腺病毒Ad-Lptn進行治療，并設PBS和Ad-lacZ為對照組，并測量腫瘤大小及觀察荷瘤小鼠的生存期。結果發(fā)現(xiàn)，與EG7對照組相比，IL-10基因修飾的EG7致瘤性降低，腫瘤生長緩慢；與PBS和Ad-LacZ對照組相比，聯(lián)合Ad-Lptn進行治療，不僅顯著抑制了腫瘤的生長，而且促進了腫瘤的消退，延長了荷瘤小鼠的生存期，尤其是IL-10基因修飾的腫瘤。機制研究發(fā)現(xiàn)，

10、瘤內(nèi)高表達的IL-10增強了小鼠的NK和CTL殺傷活性，提示機體被有效誘導產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應；聯(lián)合Ad-Lptn治療更顯著增強了小鼠的NK和CTL殺傷活性并誘導了更多的Fh1型細胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌。 進一步用半定量RT-PCR的方法檢測了腫瘤組織中IP-10、Mig、VEGF和MMP-2的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，IP-10和Mig可表達在轉(zhuǎn)染IL-10的腫瘤組織和Ad-Lptn瘤內(nèi)治療組，而未轉(zhuǎn)

11、染IL-10的EG7組及其PBS、Ad-Lacz治療組則無表達；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和間質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在轉(zhuǎn)染IL-10的腫瘤組織和Ad-Lptn瘤內(nèi)治療組的表達量較低，而未轉(zhuǎn)染IL-10的EG7組及其PBS、Ad-Lacz治療組則高表達。提示腫瘤微環(huán)境中IL-10和Lptn可能通過誘導腫瘤組織表達更多的干擾素誘導蛋-10(IP-10)和干擾素誘導單核因子(Mig)，減少VEGF和MMP-2的表達，從而發(fā)揮其抑制腫

12、瘤血管形成的抗腫瘤作用。 腫瘤組織“VEGF免疫組化和HE染色的結果與上述結論一致，結果顯示，與對照組相比，高表達IL-10組和Ad-Lptn治療組瘤內(nèi)VEGF蛋白表達降低，瘤組織壞死明顯。提示腫瘤微環(huán)境中IL-10和Lptn可能抑制了腫瘤血管生成，致使腫瘤組織缺血壞死，壞死的腫瘤組織更有利于機體對腫瘤的清除。 第三部分：CD4+ T、CD8+ T、NK細胞亞群剔除實驗 EG7T淋巴瘤生長迅速，惡性程度高，短時間

13、內(nèi)就能導致荷瘤小鼠死亡。通過腹腔注射抗CD4、抗CD8或抗NK1.1單克隆抗體，分別剔除CD4+ T、CD8+ T或NK細胞，并設大鼠IgG為陰性對照組。剔除效率經(jīng)流式細胞術檢測，結果表明在小鼠外周血和脾臟中>95％的CD4+T、CD8+T、NK細胞被成功剔除。在各種免疫細胞亞群剔除的C57BL／6小鼠中，觀察了Ad-Lptn對EG7及IL-10基因轉(zhuǎn)染的EG7 T淋巴瘤的治療效果。結果表明CD4+T、CD8+T及NK細胞在Ad-Lpt

14、n和／或IL-10抗腫瘤效應中均發(fā)揮了重要的作用，其中以CD8+T為主。 結論： 1.與EG7相比，IL-10基因修飾的EG7 T淋巴瘤生長緩慢，腫塊較小，其機制與IL-10增強了荷瘤小鼠NK、CTL殺傷活性、誘導機體產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫應答相關。 2.接受Ad-Lptn瘤內(nèi)注射治療的荷瘤小鼠腫瘤生長緩慢，腫塊較小，機制為Lptn更進一步增強了小鼠的NK和CTL殺傷活性，并誘導了更多的Th1型細胞因