蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌分子檢測技術(shù)的研究.pdf

1、蝴蝶蘭細菌性軟腐病是蝴蝶蘭的頭號殺手。Erwiniachrysanthemi(菊歐文氏菌)、Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種)是引起蝴蝶蘭軟腐病的主要病原細菌。據(jù)調(diào)查，在我國造成蝴蝶蘭軟腐病的細菌都是Erwiniachrysanthemi，被列入我國三類檢疫性有害生物。 本論文主要進行了菊歐文氏菌檢測技術(shù)的研究。 選用16S-23SrDNA間的ITS(I

2、ntergenicTranscribedSpacerRegion)序列的通用引物A(5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’)和B(5’-CAAGGCATCCACCGT-3’)，對菊歐文氏菌3個菌株進行了ITS擴增，所有菌株均得到了一條分子量約為240bp的擴增產(chǎn)物。對參試的3個菊歐文氏菌菌株的擴增片段進行片段回收、克隆和測序，將這些序列與數(shù)據(jù)庫中已報道的其它ITS序列進行同源性比較，在此基礎(chǔ)上設(shè)計并合成菊歐文氏菌特異性引物L1(5’

3、-CCGGATTGTTAAAGAGCAGA-3’)和L2(5’-GACGCCAATGACTGACAGTG-3’)。并用這對特異性引物分別對14個參試菌株進行PCR擴增，證明這對特異性引物具有很高的特異性。 利用免疫吸附技術(shù)，研制了免疫吸附-PCR技術(shù)。選用菊歐文氏菌的001菌株，由戊二醛固定全菌體抗原，制備的抗血清效價和特異性都比較高，可以用于ELISA實驗。應(yīng)用免疫吸附-PCR技術(shù)，使檢測純菌的靈敏度比標準PCR技術(shù)提高10倍

4、，檢測樣品中菊歐文氏菌靈敏度提高了100倍。該方法簡單易行，準確靈敏，具有廣泛的應(yīng)用前景。 實時熒光定量PCR技術(shù)是一種新近發(fā)展起來的檢測技術(shù)。本研究采用SYBRGREENI染料法，用多個引物分別對菊歐文氏菌進行擴增，從而進一步驗證了特異性引物L1-L2具有很高的特異性；用此法檢測樣品中菊歐文氏菌的靈敏度可達到102cfu/ml，比標準PCR技術(shù)提高了1000倍。SYBRGREENI染料法不需要設(shè)計合成序列特異性的探針，是一種簡