大鼠小體積肝移植術(shù)后早期缺血再灌注損傷機(jī)制及腺病毒介導(dǎo)心肌營養(yǎng)素-1轉(zhuǎn)染對其保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠小體積肝移植模型的建立及其早期缺血再灌注損傷特點(diǎn)及機(jī)制的初步研究 目的:建立穩(wěn)定可靠的大鼠小體積肝移植模型，比較小體積和全肝移植術(shù)后早期缺血再灌注損傷程度并初步探討其可能的損傷機(jī)制，為探尋小體積肝移植新的治療策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、方法:健康雄性Lewis大鼠，隨機(jī)分為三組：Ⅰ組sham組Ⅱ組1 00％肝移植組Ⅲ組40％小體積肝移植組。以Kamada的“二袖套法”非動脈化大鼠原位肝移植模型為基礎(chǔ)，經(jīng)過前

2、期的熟練訓(xùn)練，采用體外肝葉切除的方法，以中葉作為供肝，建立理想的40％小體積肝移植模型。觀察各組術(shù)后生存率和術(shù)后早期肝功能(AST和ALT)的變化；觀察各組術(shù)后6小時肝臟光鏡和電鏡下組織學(xué)變化；酶促反應(yīng)法測定各組術(shù)后6小時肝組織丙二(MDA焓量；酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測各組術(shù)后6小時肝組織中腫瘤壞死因子-a(TNF-a)水平；檢測三組術(shù)后6小時肝組織中髓性過氧化物酶(MPO)活性以反映肝組織中中性粒細(xì)胞浸潤情況；TUYNEL法

3、檢測三組肝術(shù)后6小時肝細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1.與全肝移植組相比，小體積肝移植組術(shù)后生存率明顯下降(pp<0.05)，小體積肝移植組7天生存率為33.3％(4/12)，全肝移植組和假手術(shù)組大鼠術(shù)后7天生存率分別為83.3％(10/12)和100％(10/10)。 2.大鼠小體積肝移植術(shù)后血清AST和ALT水平明顯增高，術(shù)后早期肝功能損害嚴(yán)重。與全肝移植相比，小體積肝移植組術(shù)后早期2、6和24小時血清AST和AL

4、T水平增高更加顯著(p<0.05)。 3.小體積肝移植術(shù)后6小時表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、明顯的肝細(xì)胞空泡樣變性，局灶性肝細(xì)胞壞死。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)線粒體嚴(yán)重腫脹，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，微絨毛減少或消失。與小肝移植組相比，全肝移植組肝組織光鏡和電鏡下?lián)p傷表現(xiàn)相對輕微。 4.小體積肝移植術(shù)后6小時肝組織MDA含量(1.83±0.32)較全肝移植組(1.19±0.23)明顯增加(p<0.01)。 5.小體

5、積和全肝移植術(shù)后6小時TNF-a水平和MPO含量明顯高于假手術(shù)組，且小肝移植組較全肝移植組增高更加明顯。40％小肝組VS全肝組，TNF-a(7.91±1.07 vs 4.56±0.73 p<0.01)；MPO(6.79±0.74 vs 4.154±0.62 p<0.01)。 6.小體積肝移植術(shù)后6小時肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(20.4±4.3)較全肝移植組(11.24±2.1)明顯增加(p<0.05)。 結(jié)論： 建立了穩(wěn)定

6、可靠的大鼠小體積肝移植模型，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。初步觀察了小體積肝移植早期再灌注損傷的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)小體積肝移植大鼠術(shù)后早期表現(xiàn)為較全肝移植更為嚴(yán)重的再灌注損傷。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激、加重的急性炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡是小體積肝移植物早期損傷加重的重要原因。 第二部分：心肌營養(yǎng)素-1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定、病毒的生產(chǎn)、擴(kuò)增和純化 目的:構(gòu)建含小鼠CT-1基因的重組腺病毒載體pAd-CT-1，經(jīng)鑒定成功后，293細(xì)胞包裝同源

7、重組產(chǎn)生腺病毒液。 方法： 將編碼小鼠CT-1cDNA基因通過PGEX4T-3-CT-1質(zhì)粒SalI-NotI酶切位點(diǎn)克隆后再經(jīng)相同的酶切位點(diǎn)亞克隆入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒載體，建立含mCT-1基因的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-CT-1。pAdTrack-CMV穿梭載體在(CMV)啟動子調(diào)控下編碼EGFP作為轉(zhuǎn)染的標(biāo)記。這個質(zhì)粒通過PmeI限制性消化成線性并與pAdEasy-1共轉(zhuǎn)入E.coli B

8、J5183細(xì)胞。重組子可以通過對卡那霉素耐藥性篩選并通過限制性酶切分析確認(rèn)。線性化的重組質(zhì)粒應(yīng)用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞株AD293內(nèi)包裝成病毒體。轉(zhuǎn)染和病毒生產(chǎn)通過GFP的表達(dá)監(jiān)測。采用CsC1密度梯度超離心法純化病毒，用空斑形成試驗(yàn)進(jìn)行病毒滴度測定。 結(jié)果： 經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后，顯示構(gòu)建的腺病毒載體中含有mCT-1基因；目的基因片段結(jié)果與Gene bank中mCT-1 cDNA序列一致。經(jīng)29

9、3細(xì)胞包裝產(chǎn)生的病毒Ad-CT-1，純化后滴度可以達(dá)到1012pfu/ml. 結(jié)論： 采用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-CT-1，重組腺病毒液滴度高，為下一部的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第三部分腺病毒介導(dǎo)心肌營養(yǎng)素-1轉(zhuǎn)染對大鼠小體積肝移植缺血再灌注損傷保護(hù)及機(jī)制的實(shí)驗(yàn) 目的:探討供肝腺病毒心肌營養(yǎng)素-1基因轉(zhuǎn)染對大鼠小體積肝移植術(shù)后早期缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用及其可能的相關(guān)機(jī)制。

10、 方法： 采用健康雄性Lewis大鼠，體重為250-320g，采用隨機(jī)化分組，實(shí)驗(yàn)分為三組：(i)AdCT-1治療組(ii)AdEGFP對照組(iii)生理鹽水對照組。供體大鼠靜脈預(yù)輸注3x109 pfuAdCT-1病毒液，對照組則分別輸注相同體積的生理鹽水或3x109 pfuAdEGFP(以上均定容至1mL)。4天后處死供體大鼠，獲取供肝，參照第一部分建立40％小體積肝移植模型，Westemblot檢測和冰凍切片觀察E

11、GFP表達(dá)證實(shí)移植物中是否有外源性CT-1過表達(dá)；術(shù)后采血檢測2、6、24小時血清AST和ALT水平變化；觀察移植術(shù)后受體大鼠生存情況；光鏡和電鏡下觀察術(shù)后6和24小時肝臟組織形態(tài)學(xué)變化；TUNEL法檢測肝組織中細(xì)胞凋亡水平；Westemblot檢測術(shù)后生存信號通道蛋白(Akt和磷酸化Akt；ERK和磷酸化ERK；Stat-3和磷酸化Stat-3)和凋亡相關(guān)蛋白(bcl-2和cleaved caspase-3)表達(dá)情況。 結(jié)果：

12、 1.供肝AdCT-1基因預(yù)轉(zhuǎn)染能明顯提高移植肝中外源性CT-1的表達(dá)。 2.AdCT-1基因預(yù)處理能明顯改善小體積肝移植術(shù)后肝臟功能，提高移植物生存率。生理鹽水和AdEGFP對照組術(shù)后7天生存率分別為33.3％(5/15)和40％(6/15)，而.AdCT-1治療組大鼠的生存率為73.3％(11/15)(p<0.05)；AdCT-1治療組大鼠術(shù)后2、6和24小時的血清AST和ALT水平較生理鹽水和.AdEGFP對照組明

13、顯降低(p<0.05 or<0.01)。生理鹽水和AdEGFP對照組術(shù)后生存率和肝功能變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.組織學(xué)分析：HE染色顯示：移植術(shù)后6小時，AdEGFP和生理鹽水對照組肝細(xì)胞明顯空泡樣變性伴局部壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；24小時后，肝細(xì)胞變性、壞死更加明顯；門靜脈周圍水腫、充血，小葉結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重。與AdEGFP和生理鹽水對照組相比，AdCT-1組變性和壞死明顯減輕。肝小葉結(jié)構(gòu)完整。電鏡結(jié)果顯示：移植術(shù)后6小時AdEG

14、FP和生理鹽水對照組肝組織線粒體明顯腫脹，微絨毛減少或消失，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙不規(guī)則擴(kuò)大。術(shù)后24小時上述改變更加明顯，部分肝竇內(nèi)皮細(xì)胞脫落、塌陷。而在AdCT-1組肝組織學(xué)結(jié)構(gòu)得到明顯的改善，線粒體輕度腫脹，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞較完整，有較多的微絨毛。 4.TUNEL結(jié)果顯示：AdCT-1組術(shù)后6小時和24小時移植肝組織中肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于AdEGFP和生理鹽水對照組(p<0.01)，AdEGFP和生理鹽水對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、。 5.Westernblot檢測顯示：AdCT-1治療組、生理鹽水和AdEGFP對照組再灌注6和24小時移植肝組織中總Akt、ERK和StaLt-3水平無明顯差異，而磷酸化Akt、ERK和Stat-3水平在AdCT-1治療組移植肝中顯著上調(diào)。 6.Westernblot檢測結(jié)果亦顯示：與生理鹽水和AdEGFP對照組相比，AdCT-1治療組再灌注6和24小時肝組織中抗凋亡蛋白bcl-2水平明顯上調(diào)，而促凋亡蛋白cleav