他莫昔芬抑制巨噬細(xì)胞FABP4表達(dá)——糖皮質(zhì)激素受體和過氧化物酶體增殖物激活受體γ依賴型機(jī)制.pdf

1、心血管疾病已經(jīng)成為人類健康與生命的重大威脅。冠心病是心血管疾病中最常見的一種，而動脈粥樣硬化(AS)則是造成冠心病的主要病理之一。動脈粥樣硬化的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如血管內(nèi)皮損傷，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，血管平滑肌細(xì)胞增生以及多種趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。其中，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化形成的起始與關(guān)鍵步驟。
　　脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)是一組同源小分子細(xì)胞胞漿蛋白，分子量為14-15 kD，能夠結(jié)合

2、疏水性脂類并對其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)亞組織轉(zhuǎn)運(yùn)。脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4，又稱為A-FABP或aP2）是細(xì)胞內(nèi)FABP家族成員之一。FABP4廣泛存在于各種正常組織、細(xì)胞中，但在脂肪組織和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。FABP4能夠可逆性結(jié)合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進(jìn)脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，F(xiàn)ABP4在其他生物學(xué)過程中尤其是代謝綜合征的許多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化發(fā)展，在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)FAB

3、P4高表達(dá)會促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，表明FABP4在動脈粥樣硬化的發(fā)展中也具有重要作用。
　　他莫昔芬（tamoxifen）是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，同時也是抗血管再生因子和蛋白激酶C的抑制劑。在體內(nèi)細(xì)胞色素P4502D6(CYP2D6)的作用下，tamoxifen可以被羥基化為四羥他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen或4-OH-tamoxifen），四羥他莫昔芬具有更強(qiáng)的SERM活性。過去20多年中，作為化療

4、藥tamoxifen在臨床上用于治療早期和晚期高表達(dá)雌激素受體的乳腺癌，同時大量的臨床前和臨床試驗(yàn)證明tamoxifen具有心血管保護(hù)功能。例如,tamoxifen可以降低絕經(jīng)后婦女心肌梗死的發(fā)生率以及降低頸總動脈的內(nèi)膜厚度;還可以增加男性晚期動脈粥樣硬化內(nèi)皮依賴性血流調(diào)控的血管擴(kuò)張;在動物模型中，tamoxifen可以降低雄性野生型小鼠和apoE-/-小鼠以及通過手術(shù)絕經(jīng)的雌猴體內(nèi)由高脂肪飲食誘導(dǎo)的動脈損傷與動脈粥樣硬化的發(fā)生。Tam

5、oxifen雖具有心血管保護(hù)功能，但其作用的具體分子機(jī)制尚未完全清楚。因此本論文研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen能否通過抑制FABP4表達(dá)以達(dá)到減少泡沫細(xì)胞形成從而抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的目的，同時我們將深入研究tamoxifen作用于FABP4表達(dá)的具體分子機(jī)制。
　　首先，分離來自于雌性和雄性野生型小鼠腹腔的原代巨噬細(xì)胞，在tamoxifen和4-OH-tamoxifen作用下，發(fā)現(xiàn)tamoxifen和4-O

6、H-tamoxifen抑制小鼠原代巨噬細(xì)胞FABP4蛋白表達(dá)且不存在性別依賴現(xiàn)象。前期研究成果表明地塞米松（Dex）、匹伐他汀(pitavastatin)與dexamethasone結(jié)合、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等皆誘導(dǎo)FABP4表達(dá)，為此，研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen對上述誘導(dǎo)作用的拮抗效果。通過Western blot檢測證明了tamoxifen和4-OH-tamoxifen能有效的拮抗

7、上述誘導(dǎo)作用。在轉(zhuǎn)錄水平上，通過Northern blot發(fā)現(xiàn)tamoxifen和4-OH-tamoxifen抑制巨噬細(xì)胞FABP4 mRNA表達(dá)，進(jìn)一步對FABP4啟動子活性進(jìn)行分析，探究tamoxifen和4-OH-tamoxifen下調(diào)FABP4表達(dá)的具體分子機(jī)制。通過分析，發(fā)現(xiàn)FABP4啟動子區(qū)域存在糖皮質(zhì)激素受體(GR)的正負(fù)調(diào)節(jié)元件(pGRE和nGRE)以及PPARγ的兩個潛在結(jié)合元件（PPRE1和PPRE2）。雙熒光素酶活

8、性實(shí)驗(yàn)和EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，tamoxifen和4-OH-tamoxifen通過激活nGRE活性并增加核轉(zhuǎn)錄因子GR與nGRE結(jié)合同時抑制PPRE1活性以及核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ與PPRE結(jié)合，從而下調(diào)FABP4啟動子活性，抑制FABP4轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。之后，利用Western blot結(jié)合熒光標(biāo)記定位實(shí)驗(yàn)證明，tamoxifen和4-OH-tamoxifen不影響GR表達(dá)，但是可以抑制由dexamethasone誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)移。

9、　　此外，檢測tamoxifen和4-OH-tamoxifen對FABP4表達(dá)的抑制作用在小鼠體內(nèi)和人血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中是否存在。分別喂食雌性和雄性apoE-/-小鼠含有tamoxifen的高脂食物（0.5％的膽固醇和21％的脂肪）一個月，之后分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脂肪組織，檢測FABP4蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致，tamoxifen以非性別依賴的方式抑制巨噬細(xì)胞和脂肪組織中FABP4蛋白表達(dá)。同時，從志愿者身上

10、獲取血液并提取白細(xì)胞，其衍生的巨噬細(xì)胞中FABP4蛋白表達(dá)同樣被tamoxifen和4-OH-tamoxifen所抑制，與小鼠體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　為研究tamoxifen是否可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，喂食雌性apoE-/-小鼠含有tamoxifen的高脂食物（雄性小鼠已有報(bào)道）16周后，完整分離出其主動脈進(jìn)行油紅O染色后觀察斑塊的形成情況，發(fā)現(xiàn)tamoxifen確實(shí)可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，通過FABP4