過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng)劑對大鼠足細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)的抑制及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分大鼠腎臟足細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　目的：
　　通過原代培養(yǎng)，獲得生物學(xué)特性更穩(wěn)定和更接近于體內(nèi)的足細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基本保證。
　　方法：
　　用高壓蒸汽滅菌的手術(shù)器械，從大鼠體內(nèi)分離腎臟，剝離腎被膜、分離腎臟皮質(zhì)，然后用剪刀剪碎，分別以大小不同的篩網(wǎng)篩離（75、18目篩網(wǎng)），以DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮篩離的的腎小球，然后接種于培養(yǎng)瓶中（事先將Ⅰ型膠原包被在培養(yǎng)瓶內(nèi)壁）。通過對大鼠腎臟足細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白進(jìn)

2、行免疫熒光染色（WT-1和Synaptopodin蛋白），對足細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　　從大鼠腎臟分離腎小球后，培養(yǎng)第5天可見細(xì)胞克隆從腎小球周圍爬出，這些細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出多邊形等上皮細(xì)胞的形態(tài)，通過免疫熒光染色，WT-1和Synaptopodin蛋白均呈陽性。
　　結(jié)論：
　　以差異過濾法分離腎小球，以WT-1和Synaptopodin作為鑒定足細(xì)胞的特異標(biāo)志蛋白，確認(rèn)得到原代培養(yǎng)的的大鼠足細(xì)胞。

3、r>　　第二部分足細(xì)胞內(nèi)PPARγ的表達(dá)與定位
　　目的：
　　研究足細(xì)胞內(nèi)PPARγ的表達(dá)和定位。
　　方法：
　　分別以RT-PCR和Western blot方法，對大鼠足細(xì)胞PPARγ mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測，同時(shí)通過免疫組化染色觀察PPARγ在足細(xì)胞中的定位。在此基礎(chǔ)上，分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM處理足細(xì)胞24小時(shí)，檢測PPARγ在足細(xì)胞中的表達(dá)變化。為了進(jìn)一步檢測作為轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的

4、生物學(xué)活性，以包含PPRE的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-PPRE和對照質(zhì)粒PRL-TK共同轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，檢測PPRE的熒光素酶活性。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)RT-PCR檢測，正常大鼠腎臟足細(xì)胞中表達(dá)PPARγ。以吡格列酮或羅格列酮分別處理足細(xì)胞，可見足細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)增加，與正常對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化染色顯示PPARγ陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和足突。吡格列酮和羅格列酮處理的足細(xì)胞，其PPRE

5、熒光素酶活性增強(qiáng)，與對照組相比，有顯著差別（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在大鼠腎臟足細(xì)胞有PPARγ表達(dá)；吡格列酮和羅格列酮誘導(dǎo)PPARγ在足細(xì)胞的表達(dá)，并增強(qiáng)其PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。
　　第三部分 PPARγ激動(dòng)劑在TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原中的作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　通過研究PPARγ激動(dòng)劑對TGFβ誘導(dǎo)的足細(xì)胞Ⅳ型膠原的表達(dá)影響，探討PPARγ激動(dòng)劑在足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原中的作用。

6、>　　方法：
　　在TGFβ10ng/ml誘導(dǎo)24小時(shí)后，分別以羅格列酮10μM和吡格列酮1μM繼續(xù)處理24小時(shí)，用ELISA方法檢測各組足細(xì)胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白的濃度，同時(shí)用免疫熒光染色的方法觀察Ⅳ型膠原蛋白的熒光表達(dá)強(qiáng)度，之后以 Ad-PPARγ-EGFP病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞或以GW9662處理各組足細(xì)胞24小時(shí)，收集標(biāo)本檢測Ⅳ型膠原蛋白在各組中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　足細(xì)胞培養(yǎng)上清Ⅳ型膠原蛋白濃度，在TGF

7、β組增加明顯，與Control組相比差異顯著（P<0.01），而在TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少，與TGFβ組相比差異顯著（P<0.05）。足細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)，與Control組相比，Pio組或Ad-PPARγ組增加，其中Ad-PPARγ組與Ad-vecto組相比增加6倍。Ⅳ型膠原的免疫熒光強(qiáng)度在TGFβ組明顯增強(qiáng)，而TGFβ+Pio組與Control組相比無明顯差別。足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原mRNA和蛋白水平在TG

8、Fβ組明顯增加，與Control組相比差異顯著（P<0.05），而TGFβ+Rosi組或TGFβ+Pio組則明顯減少，與TGFβ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)，在TGFβ+Ad-PPARγ組減少2-3倍，與TGFβ組相比，差異顯著（P<0.05），而TGFβ+GW9662組表達(dá)明顯增加，且與Control組和TGFβ+Pio組相比，均有明顯差異（P<0.05），TGFβ+Pio+GW9662組與 Contr

9、ol組相比無明顯差別。
　　結(jié)論：
　　TGFβ誘導(dǎo)Ⅳ型膠原在足細(xì)胞中的表達(dá)；PPARγ激動(dòng)劑或PPARγ在足細(xì)胞的過表達(dá)均可抑制Ⅳ型膠原蛋白的產(chǎn)生，而GW9662減弱了這種抑制作用。
　　第四部分 PPARγ激動(dòng)劑抑制TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞Ⅳ型膠原產(chǎn)生的機(jī)制研究
　　目的：
　　通過對TGFβ誘導(dǎo)下的P-Smad2/3蛋白表達(dá)和Ⅳ型膠原基因SBE熒光素酶活性變化的研究，探討Pio對TGFβ/Smad通路的影響

10、，以及PPARγ激動(dòng)劑在TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原的機(jī)制。
　　方法：
　　以TGFβ10ng/ml誘導(dǎo)足細(xì)胞，給予或不給予Pio處理，分別在0、15、30min時(shí)用Western blot方法檢測足細(xì)胞內(nèi)P-Smad2/3蛋白表達(dá)的變化。以promoter軟件進(jìn)行啟動(dòng)子分析，對Ⅳ型膠原基因上的SBE進(jìn)行預(yù)測，然后分別在各處理組細(xì)胞對此SBE序列的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　TGFβ誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)P

11、-Smad2/3蛋白的表達(dá)增加，并隨時(shí)間的延長而增加；在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TGFβ+Pio組細(xì)胞內(nèi)P-Smad2/3蛋白表達(dá)均減少，與TGFβ組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；TGFβ誘導(dǎo)下Ⅳ型膠原基因 SBE熒光素酶活性增加，而TGFβ+Pio組和TGFβ+Rosi組其活性明顯下降，與TGFβ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為P<0.01和P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　TGFβ可誘導(dǎo)磷酸化Smad2/3的表達(dá)，并且是呈現(xiàn)時(shí)