IL-6在小鼠急性肝損傷后的肝細(xì)胞再生中的相關(guān)研究.pdf

1、目的：通過小鼠肝部分切除術(shù)建立小鼠急性肝損傷的動物模型，觀察不同時間點肝損傷及肝再生的變化，探討白介素-6(IL-6)在小鼠急性肝損傷后肝再生過程中可能的作用。
　　 實驗動物和實驗方法：SPF級健康雄性6-8周齡C57b1/j6小鼠及SPF級健康雄性IL-6基因敲除C57b/j6小鼠(均購于南京大學(xué)模式動物研究所)體重18-28g，飼養(yǎng)于東南大學(xué)實驗動物中心，自由飲水，隨意進(jìn)食，12小時交替照明。將小鼠分為對照組及實驗組(IL

2、-6基因敲除小鼠)，取5只小鼠作為空白對照組用以測量小鼠正常肝重/體重比、各肝葉所占比例及小鼠血清ALT、AST、GGT、AKP、Glu正常值范圍，對照組與實驗組每組小鼠25只，每組小鼠分為6h，12h，24h，36h及48h5個時間點，每個時間點5只小鼠，稱小鼠術(shù)前及術(shù)后體重，分別于上午8:00-11:00予以1％戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后參照Higgins，Anderson[1]和湯朝暉，吳孟超[2]等及Mehrdad N

3、ikfarjam[3]的方法，切除小鼠肝臟約70％，建立模型成功后，稱切除肝臟濕重，并分別于術(shù)后6h，12h，24h，36h及48h予以1％戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，1ml空針下腔靜脈采血0.8ml，室溫靜置30min后4000 r/min離心5min，離心后留取血清檢測各組術(shù)后AST、ALT、AKP、GGT、Glu的變化，并迅速切取殘肝稱肝臟濕重后福爾馬林固定，計算肝再生率及肝臟指數(shù)，并取肝臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色

4、，研究肝再生過程中肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。每個樣本隨機(jī)取高倍鏡下10個視野，計數(shù)每個高倍視野下100個細(xì)胞中處于有絲分裂狀態(tài)細(xì)胞或雙核細(xì)胞所占比率，以增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學(xué)染色作為肝再生的指標(biāo)，高倍鏡下，每張切片隨機(jī)取高倍鏡下10個視野，計數(shù)每個高倍鏡下100個肝細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核呈棕色(無論其深淺)均視為陽性肝細(xì)胞。PCNA標(biāo)記指數(shù)=PCNA陽性肝細(xì)胞數(shù)/1000x100％。Caspase-3免疫組化染色在高

5、倍鏡下(10×40)隨機(jī)觀察5個視野，胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色者為陽性細(xì)胞，計數(shù)每個高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 HE染色：成功建立小鼠肝部分切除肝臟急性損傷模型后，實驗組和對照組術(shù)后肝組織均明顯增生，HE染色光鏡觀察示，實驗組與對照組術(shù)前肝組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色顯示，術(shù)前正常肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝血竇清晰，肝切除術(shù)后與術(shù)前比較，可見明顯的組織增生，細(xì)胞體積變大，增生的肝細(xì)胞索排列結(jié)構(gòu)有不

6、同程度紊亂，且雙核細(xì)胞數(shù)目有明顯增加，實驗組與對照組術(shù)后肝組織切片HE染色雙核細(xì)胞計數(shù)較術(shù)前升高，對照組升高較實驗組升高明顯，對照組術(shù)后12h、24h、36h、48h較術(shù)前升高明顯，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后6h較術(shù)前升高不明顯，無明顯差異(P>0.05)；實驗組術(shù)后24h、36h、48h較術(shù)前升高明顯，有明顯差異(P<0.05)。實驗組與對照組比較，對照組術(shù)后12h、24h、36h各時間點雙核細(xì)胞計數(shù)較實驗組雙核細(xì)胞升高明顯，有

7、明顯差異(P<0.01)；實驗組與對照組比較，對照組術(shù)后48h雙核細(xì)胞計數(shù)較實驗組雙核細(xì)胞升高明顯，有明顯差異(P<0.05)。術(shù)后6h兩組之間雙核細(xì)胞數(shù)目比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 肝再生率及肝臟指數(shù)：各組之間術(shù)后各時間點小鼠肝臟指數(shù)均小于正常組，有明顯差異(P<0.01)，術(shù)后6h及術(shù)后12h實驗組和對照組之間小鼠肝臟指數(shù)無明顯差異(P>0.05)，術(shù)后24h、36h實驗組小鼠肝臟指數(shù)小于對照組，有明顯差異(P<

8、0.05)，術(shù)后48h實驗組小鼠肝臟指數(shù)小于對照組，有明顯差異(P<0.01)。術(shù)后6h、12h實驗組肝再生率均低于對照組，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后24h、36h實驗組肝再生率均低于對照組，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后48h實驗組肝再生率均低于對照組，兩組間無明顯差異(P>0.05)。
　　 血清學(xué)檢測結(jié)果：術(shù)后血清中ALT、AST含量較術(shù)前明顯升高，實驗組與對照組ALT均于術(shù)后12h達(dá)到高峰，然后開始下降，實驗組A

9、LT下降較對照組緩慢；對照組AST于術(shù)后12h達(dá)到高峰后開始緩慢下降，而實驗組AST于術(shù)后24h達(dá)到高峰，且峰值較對照組大；實驗組與對照組術(shù)后各時間點血清中AST、ALT的含量較術(shù)前有明顯升高，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后36h實驗組血清中ALT含量高于對照組，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后48h實驗組血清中ALT含量高于對照組，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后12h、36h、48h實驗組血清中AST含量高于對照組，有明顯差異(P

10、<0.05)；術(shù)后24h實驗組血清中AST含量高于對照組，有明顯差異(P<0.01)。小鼠肝部分切除術(shù)后血清中AKP、GGT。含量較術(shù)前明顯升高。均于術(shù)后24h達(dá)到高峰，組間比較無明顯差異。術(shù)后6h、12h、24h、36h、48h血清中AKP、GGT較術(shù)前升高，有明顯差異(P<0.05)。小鼠肝部分切除術(shù)后血清中G1u水平較術(shù)前下降，與術(shù)前相比較有明顯差異(P<0.05)。
　　 免疫組織化學(xué)染色：實驗組與對照組小鼠肝部分切除術(shù)

11、后各時間點肝組織PCNA的表達(dá)與術(shù)前相比明顯升高，有明顯差異(P<0.01)；免疫組化示實驗組與對照組比較，術(shù)后6h小鼠殘肝組織PCNA的表達(dá)均較對照組低，兩組比較有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后12h、24h、36h、48h小鼠殘肝組織PCNA的表達(dá)均較對照組低，兩組比較有明顯差異(P<0.01)。caspase-3免疫組化可見術(shù)后6小時實驗組及對照組均有陽性表達(dá)，兩組比較有明顯差異(P<0.05)，其余各時間點未見明顯陽性表達(dá)。

12、r>　　 結(jié)論：
　　 1、在肝部分切除后，數(shù)小時內(nèi)即出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高，24h內(nèi)達(dá)到高峰，在該階段要重視肝功能的支持措施。
　　 2、小鼠肝部分切除術(shù)造成的急性肝損傷可誘導(dǎo)殘肝細(xì)胞通過細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞體積增大實現(xiàn)肝再生，并逐步使肝功能恢復(fù)。
　　 3、在小鼠肝部分切除術(shù)后急性肝損傷后6h內(nèi)殘肝即已經(jīng)啟動再生，12小時后開始有絲分裂，約在術(shù)后36小時細(xì)胞有絲分裂達(dá)高峰，且48h內(nèi)肝再生逐漸增強(qiáng)。
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