中國人群乳腺癌遺傳易感性研究.pdf

1、第一章：乳腺癌全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)與中國人群的關(guān)聯(lián)研究及交互作用分析
　　研究背景：乳腺癌是女性中最常見的一種惡性腫瘤，不管是在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家，乳腺癌均位于女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。大量的流行病學(xué)研究表明，乳腺癌是一種由環(huán)境因素與遺傳因素共同導(dǎo)致的高異質(zhì)性疾病。相同環(huán)境因素暴露情況下，個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)不盡相同，說明個(gè)體遺傳因素在決定乳腺癌的易感性方面發(fā)揮重要作用。目前，乳腺癌的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wid

2、e association studies，GWAS)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多與乳腺癌的遺傳易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(Single-nucleotide polymorphisms，SNPs)。但是大多數(shù)的GWAS都是在歐美人群中進(jìn)行，而在中國人群中的數(shù)據(jù)相對較少，同時(shí)這些 GWAS發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)之間的交互作用如何，我們還知之甚少。
　　研究目的：(1)：分析GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)與中國人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。(2)：分析關(guān)聯(lián)分析得到的風(fēng)險(xiǎn)易

3、感位點(diǎn)與絕經(jīng)狀況之間的環(huán)境-基因相乘交互作用。(3)：分析這些GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)之間的基因-基因交互作用對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。
　　研究方法：本研究我們采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照研究設(shè)計(jì)，利用多分析方法策略，采用包含隨機(jī)森林(random forest，RF)，多因子降維(multifactor dimensionality reduction，MDR)和非條件logistic回歸(logistic regression，LR)

4、的方法綜合評價(jià)GWAS發(fā)現(xiàn)的10個(gè)位點(diǎn)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以及這些位點(diǎn)之間的高階交互作用。運(yùn)用 TaqMan基因分型技術(shù)對GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測。分別采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)比較病例組和對照組人口學(xué)資料中的分類變量(如絕經(jīng)狀況)和連續(xù)性變量(如年齡等)。采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)該位點(diǎn)的基因分型是否符合HWE平衡。采用 logistic回歸模型分析單個(gè)位點(diǎn)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，應(yīng)用Haploview4.2軟件分析位點(diǎn)之間的連鎖不平衡

5、程度。
　　研究結(jié)果：(1)：本次研究共納入477例乳腺癌病例和534例健康女性對照。年齡及絕經(jīng)狀況分布在病例組與對照組中比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。病例組中，有271例病人被診斷為雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)陽性，占所有病例的56.8％，168例為 ER陰性(35.2%)；另外有241例(50.5%)患者被診斷為孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)陽性，198例(41.5%)PR陰性，此

6、外還有38例(8.0%)病人的 ER和PR信息由于資料缺失而無法獲知。(2)：在此次病例-對照研究的10個(gè)GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)中，有包含rs1219648，rs3757318，rs1926657，rs6656756，rs2046210和rs4973768在內(nèi)的6個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)行單位點(diǎn)分析時(shí)被發(fā)現(xiàn)與中國人群乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。并且在經(jīng)過了錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)的校正之后，rs3757318，rs2046210，rs4973768和rs192665

7、7四個(gè)位點(diǎn)仍然與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。(3)：對單個(gè)位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)的陽性位點(diǎn)與絕經(jīng)狀況的交互作用分析發(fā)現(xiàn)，rs3757318與絕經(jīng)狀況之間存在相乘交互作用(P=0.001)。(4)：在采用隨機(jī)森林分析中，rs3757318，rs2046210和rs4973768被認(rèn)為是乳腺癌最主要的三個(gè)危險(xiǎn)因素，同時(shí)該三個(gè)位點(diǎn)被選為是在考慮了位點(diǎn)之間交互作用的最優(yōu)疾病風(fēng)險(xiǎn)子集。接下來的多因子降維分析同樣發(fā)現(xiàn)包含rs3757318，rs2046210和rs4

8、973768的三階交互作用模型最好的解釋了位點(diǎn)之間的交互作用，其檢驗(yàn)準(zhǔn)確性(testing accuracy，TA)和交叉驗(yàn)證一致性(cross-validation consistency，CVC)分別為0.6183和10/10。隨后我們對這三個(gè)位點(diǎn)的累積效應(yīng)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)隨著含風(fēng)險(xiǎn)等位基因個(gè)數(shù)的增加，個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)也在增加，呈現(xiàn)出等位基因-劑量效應(yīng)關(guān)系(Ptrend=9.80×10-5)，含有1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)和4-6個(gè)危險(xiǎn)等位基因

9、的個(gè)體其患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是不攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因個(gè)體的2-3倍，其對應(yīng)的OR值分別為2.06(95%CI=1.40-3.01),2.37(95%CI=1.64-3.44),2.28(95%CI=1.48-3.52)和3.27(95%CI=1.96-5.48)。
　　研究結(jié)論：(1)：GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs1926657，rs1219648，rs3757318，rs2046210，rs4973768和rs6556756與中國人群乳腺癌的發(fā)病

10、風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其中rs3757318是影響乳腺癌遺傳易感性的最主要位點(diǎn)。(2)：rs3757318和絕經(jīng)狀況之間存在相乘交互作用。(3)：rs3757318，rs2046210和rs4973768在乳腺癌的遺傳易感性中發(fā)揮著非常重要的基因-基因交互作用，當(dāng)然其潛在的生物學(xué)機(jī)制需要我們更多的研究去進(jìn)行探討。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：(1)：本研究首次研究了 GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn) rs1926657，rs1978503，rs6556756以及rs2075

11、555等位點(diǎn)與中國人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系(2)：本研究采用聯(lián)合logistic回歸模型，隨機(jī)森林和多因子降維，多種統(tǒng)計(jì)分析方法綜合評價(jià)GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)之間的基因-基因交互作用
　　第二章：p53結(jié)合位點(diǎn)遺傳變異與中國人群乳腺癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)研究
　　研究背景：P53是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子之一，也是目前研究的最多、最重要的一種轉(zhuǎn)錄因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53主要通過與大量的靶基因上的特異性的DNA序列相結(jié)合，并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)

12、錄而決定細(xì)胞的生理功能。與p53相結(jié)合的DNA序列，稱為p53反應(yīng)元件(p53 response element，p53-RE)，p53與之結(jié)合的能力以及結(jié)合后對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力是 p53發(fā)揮腫瘤抑制功能的關(guān)鍵所在。因此，目前一致認(rèn)為，位于p53靶基因反應(yīng)元件上關(guān)鍵堿基功能性的遺傳變異可能會影響p53與之的結(jié)合，從而影響p53對靶基因表達(dá)的調(diào)控，并最終導(dǎo)致不同的腫瘤遺傳易感性。
　　研究目的：(1)：第一部分首先分析p53結(jié)合

13、位點(diǎn)rs4590952與中國人群乳腺癌遺傳易感性關(guān)系。(2)：第二部分研究位于乳腺組織特異性的p53結(jié)合位點(diǎn)的遺傳變異與中國人群乳腺癌遺傳易感性的關(guān)系。
　　研究方法：首先采用大樣本病例-對照關(guān)聯(lián)研究，探討位于KITLG基因上的rs4590952與中國人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。第二部分利用公共數(shù)據(jù)庫或者已發(fā)表的文章數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)的方法，提取在乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行的ChIP-seq數(shù)據(jù)，然后利用Mach軟件篩選位于p53靶基因結(jié)

14、合區(qū)域，可能影響p53結(jié)合而影響p53功能的多態(tài)位點(diǎn)。接下來采用兩階段大樣本病例-對照關(guān)聯(lián)研究，研究通過上述方法篩選出來的p53反應(yīng)元件上的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與乳腺癌遺傳易感性的關(guān)系。采用TaqMan基因分型方法對該位點(diǎn)進(jìn)行分型。分別采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)比較病例組和對照組人口學(xué)資料中的分類變量(如絕經(jīng)狀況，是否吸煙飲酒等)和連續(xù)性變量(如年齡等)。采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)該位點(diǎn)的基因分型是否符合HWE平衡。采用非條件logistic回歸模型分析該

15、位點(diǎn)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
　　研究結(jié)果：(1)：第一部分研究共納入1241例乳腺癌患者和1259例健康女性對照。病例組和對照組年齡比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.942)。同時(shí)，病例組和對照組在絕經(jīng)狀況以及吸煙飲酒等分布上也無差別，其 P值分別為0.117,0.123和0.721。在乳腺癌病人中，有802(64.60%)例病人被診斷為ER陽性，439(35.40%)例病人被診斷為ER陰性。而對于PR，分別有712例病人和529

16、例病人被診斷為PR陽性和PR陰性，分別占所有病人的57.40%和32.60%。在經(jīng)過年齡、絕經(jīng)狀況和吸煙飲酒等因素校正后，與rs4590952-G等位基因比較，logistic回歸分析沒有發(fā)現(xiàn)rs4590952-A等位基因會增加中國人群乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.04,95%CI=0.73-1.46，P=0.839)。其他雜合子模型、突變純和模型以及顯性模型、隱性模型和加性模型均未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與乳腺癌的易感性相關(guān)。根據(jù)患者ER和PR的表達(dá)

17、與否的分層分析發(fā)現(xiàn)，在ER+/PR+和ER-PR-乳腺癌亞型中仍然沒有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與乳腺癌的陽性關(guān)聯(lián)。(2)：第二部分第一階段研究共納入1274例乳腺癌病例和1255例健康女性對照。病例組和對照組年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值等于0.318。同時(shí)病例組和對照組在絕經(jīng)狀況分布以及吸煙飲酒分布上也無差別，其對應(yīng)的P值分別為0.539,0.258和0.131。在第二階段中，共納入753例病例和1199例對照，病例組和對照組在年齡和絕經(jīng)狀況分布上比較

18、均無差異(P值分別為0.397和0.507)。第一階段在三個(gè)位點(diǎn)中，位于 VMP1基因上的rs1295925其基因型分布的差異在病例組和對照組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在經(jīng)過年齡、絕經(jīng)狀況以及吸煙飲酒等因素的校正之后，攜帶rs1295925-CT和TT基因型的個(gè)體與攜帶rs1295925-CC基因型的個(gè)體相比，其患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了32%(OR=1.32,95%CI=1.07-1.62)和41%(OR=1.41,95%CI=1.13-1.78)

19、。在其他等位基因模型、顯性模型以及加性模型中也均發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的陽性結(jié)果。且在進(jìn)行了多重檢驗(yàn)的FDR校正之后，rs1295925仍然與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。而另外兩個(gè)位于 BCAS1基因上的位點(diǎn)則沒有發(fā)現(xiàn)它們與乳腺癌相關(guān)的證據(jù)。第二階段對陽性位點(diǎn)rs1295925的進(jìn)一步驗(yàn)證同樣得到了該位點(diǎn)與乳腺癌易感性相關(guān)的結(jié)果。將兩階段進(jìn)行合并，仍得到該位點(diǎn)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的陽性關(guān)聯(lián)。第一階段根據(jù)病人的 ER和PR表達(dá)情況進(jìn)行的分

20、層分析發(fā)現(xiàn)，rs1295925與ER-PR-亞組發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)比ER+/PR+亞組強(qiáng)。在ER-PR-亞組中，攜帶rs1295925-CT和TT基因型患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是rs1295925-CC基因型的1.69倍和1.79倍。而在ER+/PR+亞組中，沒有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與乳腺癌具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。
　　研究結(jié)論：(1)：rs4590952這個(gè)位點(diǎn)與中國人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，一方面可能KITLG基因在乳腺癌的發(fā)生過程中沒有發(fā)揮我們預(yù)期的

21、功能，另一方面可能是該基因上的其他我們沒有發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。(2)：rs4590952這個(gè)位點(diǎn)對腫瘤的易感性可能存在組織差異。(3)：位于VMP1基因上的rs1295925可能是乳腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素
　　創(chuàng)新點(diǎn)：(1)：本研究首次在中國人群中研究位于 KITLG基因上 rs4590952與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。(2)：將生物信息學(xué)和分子流行病學(xué)相結(jié)合，充分利用現(xiàn)有資源，研究p53結(jié)合區(qū)域上三個(gè)位點(diǎn)的突變與中國人群乳