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文檔簡介
1、目的:
借助于LCWE誘導(dǎo)的川崎病冠狀動(dòng)脈炎的小鼠模型,探究Notch4信號(hào)通路在川崎病免疫性冠狀動(dòng)脈炎中的作用。
方法:
干酪乳桿菌購自CICC(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心),取對數(shù)生長期細(xì)菌用于所有實(shí)驗(yàn)。
第一部分:LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的建立
干酪乳桿菌首先在MRS broth中培養(yǎng)24小時(shí),SDS過夜裂解細(xì)菌,依次加入RNase,DNase和胰酶,超聲處理破碎細(xì)胞,
2、離心取上清,使用硫酸-苯酚比色法檢測上清液中糖總量。向BALB/c小鼠腹腔注射LCWE0.5ml(處理組)和PBS0.5ml(對照組),3天、7天、14天及28天后處死小鼠,取心臟和脾臟用4%多聚甲醛中常規(guī)固定,HE染色觀察心臟和脾臟的病理變化。使用Real-time PCR技術(shù)檢測脾臟Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化。
第二部分:Notch4通路與LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷關(guān)系
3天、7天、14天及28天摘除小鼠眼球
3、取血,先后加入cd34-eFlour66010ul, Flk-1 FITC2ul,Notch4-PE5ul,cd45-PE-Cy5.50.5ul孵育,上機(jī)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中EPCs含量及其表面Notch4表達(dá)情況。設(shè)計(jì)引物GAPDH、Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin,使用Real-time PCR技術(shù)檢測胸主動(dòng)脈、心肌組織Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin mRNA表達(dá)情況。
4、使用免疫組化技術(shù)檢測胸主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈起始部vcam-1和P-selectin表達(dá)情況。
結(jié)果:
第一部分:LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的建立
1.3天時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重明顯減輕。
2.心肌HE染色顯示各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組冠狀動(dòng)脈及其分支靠血管外膜處出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。
3.實(shí)驗(yàn)組脾臟大體觀察脾臟體積增大,重量增加,HE染色發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)主要以脾小體增生,融合。
4.實(shí)驗(yàn)組除IL-6外
5、,其他Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)量顯著增加。
第二部分:Notch4和RBP-JK與冠狀動(dòng)脈損傷相關(guān)
1.LCWE注射3天小鼠外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量顯著高于對照組,14天時(shí)實(shí)驗(yàn)組EPCs含量低于對照組;LCWE注射7天EPCs表面Notch4表達(dá)量明顯高于對照組。
2.14天,28天實(shí)驗(yàn)組胸主動(dòng)脈P-selectin mRNA和RBP-JK mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組,P-selectin與RBP-
6、JK,Notch4與vcam-1顯著相關(guān);心肌中P-selectin與RBP-JK顯著相關(guān)。
3.實(shí)驗(yàn)組冠狀動(dòng)脈起始部血管內(nèi)皮細(xì)胞vcam-1表達(dá)除7天外,各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均不同程度升高,其中以3天組升高最為明顯;胸主動(dòng)脈中段實(shí)驗(yàn)組3,7天vcam-1表達(dá)高于對照組,但表達(dá)強(qiáng)度不及3天冠脈起始部;實(shí)驗(yàn)組P-selectin冠脈起始部14天,28天表達(dá)高于對照組,胸主動(dòng)脈中段14天時(shí)強(qiáng)于對照組。
結(jié)論:
1.循環(huán)
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