魔芋耐熱性鑒定及熱激蛋白HSP基因的克隆與初步分析.pdf

1、魔芋（Amorphophallus rivieri）喜溫不耐熱，高溫是影響其產量和品質的主要非生物脅迫因素之一。在我國西南主要魔芋種植區(qū)域，特別是川渝芋區(qū)，周期性的熱害常有發(fā)生，因此，篩選耐熱種質資源、選育耐熱新品種尤為重要。種質材料的耐熱性鑒定是魔芋耐熱育種的基礎，然而目前我們對魔芋耐熱的生理機制、分子機制及互作調控機理的細節(jié)知之甚少。本研究根據前人對魔芋田間農藝性狀的觀察結果，選取耐熱性差異明顯的3個魔芋種為實驗材料，分別從生理生化

2、和分子生物學兩方面研究了魔芋耐熱的生理基礎與調控機制，以期為進一步研究魔芋耐熱因子表達調控和功能分析奠定基礎。
　　本實驗以耐熱性明顯不同的白魔芋（Amorphophallus albus，Aa）、花魔芋（Amorphophallus konjac，Ak）和珠芽魔芋（Amorphophallus bulbifer，Ab）為試材。通過測定43℃高溫脅迫下葉片生理生化指標含量的變化、觀察葉片微觀組織結構以及統(tǒng)計熱害指數的變化，掌握了高

3、溫脅迫下3種魔芋試材主要耐熱指標的變化規(guī)律，明確了不同魔芋種耐熱性強弱以及篩選能有效反映魔芋耐熱性差異的指標，探討了魔芋耐熱的生理機制；利用已經公開的耐熱相關熱激蛋白基因同源序列設計引物，克隆了3種魔芋材料熱激蛋白基因sHSP、HSP70和HSP90，并根據已測序序列設計半定量RT-PCR引物，研究了不同時間高溫脅迫下sHSP、HSP70和HSP90在魔芋葉片中的表達情況。主要研究結果如下：
　　1．魔芋的耐熱性鑒定
　　利

4、用耐熱性差異明顯不同的白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋試材，測定了43℃高溫脅迫下不同魔芋葉片相關耐熱指標。結果表明，高溫處理后，Aa葉片中CAT活性、SP和Pro含量的大小和增幅均大于Ak和Ab，Ab居中，Ak最?。籄k葉片中REC和MDA含量的大小和增幅最高，Ab居中，Aa最小；高溫處理6h、18h和24h，Aa葉片中SOD和APX活性及增幅均顯著大于Ab和Ak；高溫處理6h后，Aa葉片中SS含量及增幅顯著高于Ab和Ak。同時高溫脅迫過程中

5、，Aa葉片中Pn、Tr、Chl a/b的大小和降幅均大于Ab和Ak，處理1d、2d和4d的葉片中Gs和Ci大小依次是Aa、Ab和Ak。供試材料在高溫脅迫過程中，Aa葉片的氣孔密度和開度大于Ab和Ak，其葉肉細胞受到高溫脅迫的影響和損傷也最低，處理4d后，熱害指數差異顯著，Aa最低，其次是Ab和Ak。表明CAT、SP、Pro、REC、MDA、Chl a/b、Pn、Tr、微觀組織結構和熱害指數十個耐熱指標的變化規(guī)律能夠準確反映魔芋耐熱性差異

6、，可用于耐熱性鑒定，3種供試材料的耐熱性強弱依次是白魔芋Aa、珠芽魔芋Ab和花魔芋Ak。POD活性指標在高溫脅迫下變化復雜，與各種間耐熱性無顯著相關。
　　2．魔芋HSP基因的克隆與序列分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋為試材，通過同源克隆法獲得AasHSP、AksHSP和AbsHSP基因片段大小均為468bp，包含全長開放閱讀框，編碼155個氨基酸殘基。生物信息學方法分析表明，蛋白分子量分別為17.284、17.270和

7、17.095kDa；等電點為6.84、6.84和6.31；氨基酸序列C端均含有典型的ACD保守結構域；與半夏PtsHSP的親緣關系最近。同源克隆法獲得AaHSP70、AkHSP70和AbHSP70基因片段大小分別為1944bp、1947bp和1944bp，包含全長開放閱讀框，各自編碼647、648、647個氨基酸殘基。生物信息學分析表明，蛋白分子量分別為71.069、71.054和71.023kDa；等電點為5.14、5.16和5.17

8、；氨基酸序列N端均含有高度保守的NBD結構域；與芭蕉MaHSP70和棉花GrHSP70親緣關系最近。同源克隆法獲得AaHSP90、AkHSP90和AbHSP90基因片段大小均為2103bp，包含全長開放閱讀框，編碼700個氨基酸殘基。生物信息學分析表明，蛋白分子量分別為80.036、80.056和80.188kDa；等電點為5.01、5.01和5.00；氨基酸序列N端均含有ATPase保守結構域；與芭蕉MaHSP90親緣關系最近。

9、>　　3．高溫脅迫下HSP基因的半定量RT-PCR分析
　　以白魔芋、花魔芋和珠芽魔芋為試材，利用半定量RT-PCR技術分析了不同基因在高溫脅迫不同時間下葉片表達情況。結果顯示，感熱種花魔芋AksHSP在熱激0.5h后表達量迅速增加到最高值，而耐熱種白魔芋AasHSP和珠芽魔芋AbsHSP基因熱激響應時間較AksHSP長，在2h后達峰值，且AasHSP基因的表達峰值及表達總量均明顯高于AksHSP和AbsHSP。感熱種花魔芋AkH

10、SP70在熱激0.5h后表達量迅速增加到最高值，而白魔芋AaHSP70和珠芽魔芋AbHSP70基因熱激響應時間較AkHSP70長，分別在2h和5h后達峰值，且AaHSP70基因的表達量明顯高于其余二者。感熱種花魔芋AkHSP90在熱激0.5h后表達量迅速增加到最高值，而耐熱性更強的白魔芋AaHSP90和珠芽魔芋AbHSP90基因熱激響應時間較AkHS90P長，分別在2h和1h后達峰值，且AaHSP90基因的的表達峰值及表達總量均明顯高于