食管鱗癌細胞抗失巢凋亡UBCH7基因的篩選與鑒定.pdf

1、目的:食管鱗癌是人類十大惡性腫瘤之一,其死亡率居我國惡性腫瘤死因第四位。失巢凋亡是內(nèi)皮及上皮細胞脫離細胞外基質(zhì)發(fā)生細胞凋亡的一種特殊的死亡形式,細胞獲得抵抗失巢凋亡能力是腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提條件之一。雖然一些研究提示,Maspin、SKP2、xCT、PTTG1、TM4SF3、ECRG2、CTTN和CyclinB1等基因表達的改變可影響ESCC細胞在體內(nèi)的致瘤及轉(zhuǎn)移能力,本課題組前期在食管磷癌研究中也已發(fā)現(xiàn)多個抗失巢凋亡相關(guān)的癌基因

2、,盡管這些基因都可參與食管鱗癌細胞失巢凋亡抗性的調(diào)節(jié),但它們是通過不同的信號通路發(fā)揮作用,這些結(jié)果顯示食管鱗癌細胞中存在復雜的信號網(wǎng)絡以適應宿主微環(huán)境,從而賦予食管鱗癌細胞更強的轉(zhuǎn)移潛能。本實驗主要目的是在食管磷癌中尋找更多與抗失巢凋亡相關(guān)的基因,以進一步闡明食管鱗癌細胞轉(zhuǎn)移的分子機制,開發(fā)有效的誘導腫瘤細胞失巢凋亡的策略,從播散環(huán)節(jié)阻止腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,有可能成為預防和控制腫瘤擴散的一條有效途徑。方法:采用逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫功能篩選的手段

3、,首先構(gòu)建食管磷癌細胞系的逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫,并感染對失巢凋亡較敏感的NIH3T3細胞,利用感染病毒cDNA文庫中混合細胞系進行軟瓊脂集落形成實驗,挑取出在懸浮條件下仍可生長形成較大集落的細胞單克隆(即潛在具有抵抗失巢凋亡能力的細胞),最后通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異引物PCR擴增失巢凋亡抗性克隆基因組中的外源插入片段,在食管癌細胞系cDNA文庫中獲得潛在的具有失巢凋亡抗性的基因。結(jié)果:發(fā)現(xiàn)經(jīng)食管癌逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA文庫感染的NIH3T3細胞經(jīng)軟

4、瓊脂懸浮培養(yǎng)后,大部分克隆形成的多個抗失巢凋亡集落與感染pMSCV-GFP的NIH3T3細胞形態(tài)有明顯差別,挑取直徑明顯大于對照組的克隆細胞,將獲得的失巢凋亡抗性克隆擴大培養(yǎng),提取基因組DNA,采用逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性的pMSCV5’和pMSCV3’引物,擴增靶細胞基因組中的外源插入片段,結(jié)果顯示親本NIH3T3細胞組未擴增出產(chǎn)物,感染pMSCV-cDNA的靶細胞組擴增了食管癌混合cDNA文庫中各種長度的cDNA。經(jīng)測序和數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)其

5、中一個克隆整合有UBE2L3/UBCH7基因。為驗證逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫功能篩選實驗的準確性,利用攜帶pMSCV-UBCH7的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細胞,在NIH3T3中高表達UBCH7基因,發(fā)現(xiàn)可顯著增強NIH3T3細胞抵抗失巢凋亡能力;與此同時,以具有高轉(zhuǎn)移潛能、高失巢凋亡抗性、且高表達UBCH7蛋白的MLuC1食管癌細胞系作為模型,利用兩個特異性siRNA序列分別敲降MLuC1細胞中UBCH7,發(fā)現(xiàn)降調(diào)UBCH7表達后,導致MLuC