苦參、黃芪藥對(duì)配伍對(duì)病毒性心肌炎的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 探討研究苦參、黃芪藥對(duì)以苦參中槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、黃芪中黃芪甲苷和以增強(qiáng)小鼠免疫功能為指標(biāo)確定最佳提取方法和最佳配伍比例；研究苦參、黃芪藥對(duì)配伍后對(duì)苦參中氧化苦參堿、氧化槐果堿在大鼠體內(nèi)血藥濃度影響；苦參、黃芪及苦參、黃芪藥對(duì)提取物體外抗CVB3病毒及體外對(duì)感染CVB3病毒SD大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究；研究苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3誘導(dǎo)Balb/c小鼠心肌炎的治療作用；研究苦參

2、、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3誘導(dǎo)Balb/c小鼠心肌炎治療的可能機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、苦參、黃芪藥對(duì)的最佳提取方法、比例的確定：苦參、黃芪藥對(duì)用水分提合并、水合提取、醇分提合并、醇合提取四種提取方法，苦參、黃芪藥對(duì)按生藥量比例1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1、5:1混合，通過紫外分光光度法測(cè)定總生物堿、高效液相色譜法測(cè)定苦參中槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、黃芪

3、中黃芪甲苷指標(biāo)性成分和增強(qiáng)小鼠免疫功能影響的藥效研究，確定了苦參、黃芪藥對(duì)最佳提取方法、最佳配伍比例。
　　 2、苦參、黃芪藥對(duì)提取物、單味藥苦參提取物中氧化苦參堿、氧化槐果堿在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究：分別取健康大鼠6只，雌、雄各半，取空白血漿0.5 mL后，分別灌胃給藥（黃芪、苦參藥對(duì)提取物和苦參提取物），于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h，各從大鼠眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，進(jìn)行血漿內(nèi)苦參、黃

4、芪藥對(duì)提取物、苦參提取物中有效成分氧化苦參堿、氧化槐果堿的藥代動(dòng)力學(xué)分析。
　　 3、苦參、黃芪及苦參、黃芪藥對(duì)提取物體外抗CVB3病毒及體外對(duì)感染CVB3病毒SD大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究：在體外CVB3病毒感染的培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型成功建立的基礎(chǔ)上，分病毒對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、陽性對(duì)照藥干擾素組，苦參提取物高、中、低劑量組，黃芪提取物高、中、低劑量組，苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中、低劑量組，分別于第2、5d時(shí)間點(diǎn)，在倒置顯微

5、鏡下測(cè)定每孔細(xì)胞搏動(dòng)速率，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，吸取上清液測(cè)定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量和測(cè)定藥物抑制病毒滴度。
　　 4、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎治療作用實(shí)驗(yàn)研究：純系雄性Balb/c小鼠，4周齡（體重為12g左右），設(shè)苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中、低劑量組，另外設(shè)三個(gè)對(duì)照組：空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、玉丹榮心丸陽性對(duì)照組，每組二十只小鼠，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率，分別在第7d、14d無菌條件下取心臟，

6、用HE染色方法觀察小鼠心肌損傷、測(cè)定心肌病毒滴度。
　　 5、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治療作用機(jī)制研究：純系雄性Balb/c小鼠，4周齡（體重為12g左右），設(shè)苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中、低劑量組，另外設(shè)三個(gè)對(duì)照組：空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、玉丹榮心丸陽性對(duì)照組，給藥14d后通過免疫組化、原位雜交方法和原位末端標(biāo)記法對(duì)組織進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)分析，觀察心肌顆粒酶B的蛋白、BCL-2基因表達(dá)，Caspas

7、e3的蛋白、基因表達(dá)，及心肌細(xì)胞凋亡情況，探索苦參、黃芪藥對(duì)提取物治療CVB3感染心肌炎的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.苦參、黃芪藥對(duì)的最佳提取方法、最佳配伍比例的確定
　　 苦參、黃芪藥對(duì)經(jīng)乙醇合提取，用高效液相色譜法測(cè)定苦參中槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿五種生物堿的含量最高，分別為1.0128、2.9458、1.0803、0.71790、3.0960mg·g-1，黃芪甲苷含量0.119

8、20mg·g-1，用分光光度法總生物堿含量3.1880mg·g-1，通過對(duì)小鼠免疫功能影響的研究，苦參、黃芪藥對(duì)經(jīng)乙醇合提對(duì)小鼠免疫功能影響明顯優(yōu)于與其它提取方法對(duì)小鼠的免疫功能影響。
　　 苦參、黃芪藥對(duì)4:1配伍用高效液相色譜法測(cè)定苦參中槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿5種生物堿的含量較高高，分別為3.9020、10.740、2.4293、2.2400、6.9530mg·g-1，苦參、黃芪2:1配伍黃芪甲苷含量

9、最高為0.13060mg·g-1，用分光光度法測(cè)總生物堿苦參、黃芪5:1配伍含量最高為3.4740 mg·g-1，通過對(duì)小鼠免疫功能影響的研究，苦參、黃芪藥對(duì)2:1配伍比例對(duì)小鼠免疫功能影響明顯優(yōu)于與其它配伍比例對(duì)小鼠的免疫功能影響。在中藥配伍的運(yùn)用中，我們不僅要考慮單昧藥物的劑量，更要注意藥物用量之間的比例。通過配伍，既能增強(qiáng)原藥物的作用，更能調(diào)和偏性，取長補(bǔ)短，發(fā)揮藥物配伍的長處，使各具特征的藥物形成一個(gè)新的有機(jī)整體，以適應(yīng)復(fù)雜病癥

10、的治療需要。在本實(shí)驗(yàn)中，以中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)依據(jù)，以藥理療效結(jié)果為主要依據(jù)，有效成分含量為輔助指標(biāo)，最終確定苦參、黃芪按生藥量配伍的最佳比例為2:1。
　　 2、苦參、黃芪藥對(duì)提取物、單味藥苦參提取物中氧化苦參堿、氧化槐果堿在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 大鼠灌胃苦參、黃芪藥對(duì)提取物后的氧化苦參堿在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度為2.010μg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間為6小時(shí)，藥物分子在體內(nèi)0-24小時(shí)的平均停留時(shí)間為12.9

11、1小時(shí)，0-24小時(shí)藥時(shí)曲線下面積為22.61mg/L*h；苦參藥材中的氧化苦參堿在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度為6.526μg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間為4小時(shí)，藥物分子在體內(nèi)0-24小時(shí)的平均停留時(shí)間為15.70小時(shí)，0-24小時(shí)藥時(shí)曲線下面積為46.50mg/L*h。將藥對(duì)提取物和苦參藥材提取物處理結(jié)果相比較，可得知，黃芪、苦參藥對(duì)配伍后達(dá)峰時(shí)間有所延后，除MRT（藥物分子在大鼠體內(nèi)的平均停留時(shí)間）較苦參藥材提取物大，其余統(tǒng)計(jì)據(jù)參數(shù)均小于苦參

12、藥材提取物。
　　 大鼠灌胃苦參、黃芪藥對(duì)提取物后的氧化槐果堿在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度為3.954μg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間為6小時(shí)，藥物分子在體內(nèi)0-24小時(shí)的平均停留時(shí)間為8.679小時(shí)，0-24小時(shí)藥時(shí)曲線下面積為43.31mg/L*h；苦參藥材中的氧化槐果堿在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度為2.202μg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間為4小時(shí)，藥物分子在體內(nèi)0-24小時(shí)的平均停留時(shí)間為9.385小時(shí)，0-24小時(shí)藥時(shí)曲線下面積為26.11m

13、g/L*h。從統(tǒng)計(jì)據(jù)參數(shù)結(jié)果分析，給苦參藥材的血藥達(dá)峰時(shí)間為4小時(shí)，而給藥對(duì)的為6小時(shí)，苦參藥材明顯比藥對(duì)的時(shí)間短，一般會(huì)認(rèn)為苦參中的氧化槐果堿吸收的較快，更易被大鼠吸收，但是從大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度分析，給苦參的血藥最大濃度為2.202μg·mL-1，而給藥對(duì)的則是3.954μg·mL-1，藥對(duì)明顯高于苦參，說明藥對(duì)中的氧化槐果堿比較容易被大鼠吸收。此外從AUC（藥時(shí)曲線下峰面積）來看，苦參、黃芪藥對(duì)明顯高于苦參藥材，認(rèn)為苦參、黃芪藥

14、對(duì)提取物能促進(jìn)氧化槐果堿的吸收。
　　 3、苦參、黃芪及苦參、黃芪藥對(duì)提取物體外抗CVB3病毒及體外對(duì)感染CVB3病毒SD大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究
　　 在第2d時(shí)，苦參提取物高劑量組，苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中劑量組與病毒對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05），但是苦芪的高、中劑量組與苦參高劑量組沒有顯著性差異（P>0.05），但在第5d天時(shí)，苦參高、中劑量組和苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中、低劑量組與病毒對(duì)照組有顯著性

15、差異（P<0.05），并且苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中劑量組與苦參高、中劑量組有顯著性差異（P<0.05）
　　 4、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治療作用實(shí)驗(yàn)研究
　　 通過死亡率統(tǒng)計(jì)、病毒滴定分析、病理切片結(jié)果分析在7d時(shí)，只有高劑量苦參、黃芪藥對(duì)提取物組有降低死亡率、對(duì)病毒的有抑制及保護(hù)心肌作用。在第14d時(shí)苦參、黃芪藥對(duì)提取物高、中、低均能對(duì)病毒的有抑制及保護(hù)心肌作用，并且有良好的劑量-

16、效用關(guān)系。
　　 5、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治療作用機(jī)制研究
　　 給藥14d后通過免疫組化、原位雜交方法和原位末端標(biāo)記法對(duì)心肌組織進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)分析，苦參、黃芪藥對(duì)提取物能夠降低心肌顆粒酶B的蛋白、Caspase3的蛋白、基因及心肌細(xì)胞凋亡情況表達(dá)，上調(diào)BCL-2基因表達(dá)，苦參、黃芪藥對(duì)提取物的高、中、低劑量對(duì)蛋白、基因表達(dá)水平有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、

17、苦參、黃芪藥對(duì)最佳提取方法為乙醇合提取，最佳配伍比例為2:1。
　　 2、苦參、黃芪藥對(duì)提取物中黃芪能夠促進(jìn)苦參中氧化槐果堿吸收，促進(jìn)氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為苦參堿而被吸收。
　　 3、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞的保護(hù)及抗病毒作用優(yōu)于單味藥苦參、黃芪。
　　 4、苦參、黃芪藥對(duì)提取物對(duì)CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎有治療作用。
　　 5、苦參、黃芪藥對(duì)提取物可能是通過降低心肌顆粒酶B的蛋白