日本血吸蟲過氧化物酶(SjPrxs)的制備及結(jié)晶學(xué)研究.pdf

1、血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是一種對人畜健康危害極大的寄生蟲病，主要流行于非洲、亞洲和南美洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)。血吸蟲病是一個世界性的公共衛(wèi)生問題，在我國主要流行的是日本血吸蟲病(Schistosoma japonicum)?，F(xiàn)在，吡喹酮（Praziquantel）被作為主要的有效化學(xué)治療藥物，單一化療藥物的大量重復(fù)使用有可能導(dǎo)致血吸蟲產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果，已有研究報道對吡喹酮產(chǎn)生抗性的曼氏血吸蟲（Schistosom

2、a mansoni）蟲株。因此，開展針對日本血吸蟲藥物靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究對血吸蟲病的防治具有重要意義。
　　日本血吸蟲體內(nèi)三種硫氧還蛋白過氧化物酶（SjPrxs）基因SjPrx1、SjPrx2和SjPrx3，均屬2-Cys類型，分別存在于日本血吸蟲不同組織部位，執(zhí)行各自的抗氧化生物學(xué)功能。研究結(jié)果表明，SjPrx1在日本血吸蟲抵抗過氧化氫與有機過氧化物的損害中扮演了重要的角色，是清除機體尤其是宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧（ROS

3、）的主要執(zhí)行者，對于日本血吸蟲長期寄生于宿主體內(nèi)時抵抗氧化壓力保護(hù)蟲體不被消滅發(fā)揮了重要的作用，SjPrx2和SjPrx3也有清除ROS功能。SjPrxs是一類潛在的抗血吸蟲病藥物靶標(biāo)蛋白。
　　本論文對日本血吸蟲SjPrxs家族蛋白SjPrx1，SjPrx2和SjPrx3進(jìn)行了重組表達(dá)、分離純化和晶體生長研究，初步解析了SjPrx1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。主要研究結(jié)果包括：
　?。?）N末端帶有6×His Tag的重組表達(dá)質(zhì)粒sy

4、nSjPrx1-pET28a和wtSjPrx1-pET28a在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，獲得胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白，分子量大小約為25 kD。表達(dá)條件為OD600為1.0時加入終濃度為0.8 mM的IPTG，低溫（24℃）誘導(dǎo)18 h，獲得較高的表達(dá)量。目的蛋白經(jīng)Ni2+柱和DEAE柱純化，純度高于95％，蛋白酶活實驗表明synSjPrx1有活性。synSjPrx1蛋白濃縮至42 mg/mL，在0.2 M NH4Cl，0.

5、2 M Tris-HCl，pH7.5，0.025 M CaCl2條件獲得分辨率達(dá)3.05?的單晶，晶體結(jié)構(gòu)表明在一個非對稱單元中有三個分子，分子的C末端18個氨基酸殘基電子云未見。
　?。?）克隆C末端帶有6×His Tag的wtSjPrx1-pET42a，將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒wtSjPrx1-pET42a在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，獲得胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白。經(jīng)Ni2+柱和DEAE柱純化，純度高于95%，濃縮至45 mg/

6、mL（wtSjPrx1），在試劑盒初步篩選下，在1.0 M Ammonium sulfate，0.1 M HEPES pH7.0，0.5%Polyethylene glycol8000和0.1 M Sodium malonate pH7.0，12%Polyethylene glycol3350條件下能夠生長出有比較規(guī)則菱形晶體和有一定厚度的多邊形晶體。
　　（3）克隆wtSjPrx2-pET28a和wtSjPrx3-pET28a重