節(jié)律基因mPer2對腫瘤細(xì)胞γ射線損傷敏感性的影響及其擇時(shí)放療的初步研究.pdf

1、目的： 放射治療是腫瘤治療的主要手段之一，大約70％的腫瘤患者需要放療的介入。理論上，足夠大的放射劑量能夠殺死所有腫瘤細(xì)胞，但周圍正常組織的放射損傷限制了腫瘤治療劑量的進(jìn)一步增加，在有限治療劑量下，尋求能夠影響細(xì)胞對射線敏感性的干預(yù)措施，無疑將對腫瘤的治療具有重要意義。時(shí)間生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物體正常組織及腫瘤組織在細(xì)胞生理、生化等生長代謝的生命活動中均存在生物節(jié)律性，根據(jù)生物體的節(jié)律特征進(jìn)行施治，已證實(shí)可以提高療效并且降低機(jī)體對

2、治療措施本身的毒副反應(yīng)。本課題即首先探討了主要生物節(jié)律基因之一mPer2對<'60>Co-γ射線敏感性的影響，通過對細(xì)胞增值以及DNA損傷程度對mPer2影響細(xì)胞射線敏感性的高低作出判斷，進(jìn)而在體內(nèi)、體外腫瘤細(xì)胞mPer2節(jié)律表達(dá)的不同時(shí)間對細(xì)胞及荷瘤動物進(jìn)行照射，觀察擇時(shí)放射對腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織生長情況以及不同時(shí)間照射對小鼠毒副作用的影響，最后采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的研究方法對mPer2在射線照射過程中對其下游鐘控基因，包括DNA

3、損傷修復(fù)基因，細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控及可能的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行探討，闡明節(jié)律基因mPer2影響細(xì)胞射線損傷敏感性的分子作用機(jī)制，為腫瘤的治療開辟新的途徑。 方法： 1采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的mPer2基因重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-mPer2轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞，并以pcDNA3.1（+）-vector空載體及單獨(dú)加入脂質(zhì)體空白組為對照，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同劑量照射下細(xì)胞的克隆形成率，進(jìn)一步通過生存

4、擬合曲線得出相應(yīng)放射生物學(xué)參數(shù)（Do、Dq及N值），同時(shí)通過DNA斷片分析及單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察不同組細(xì)胞受射線照射后DNA損傷程度，從而對細(xì)胞內(nèi)mPer2高表達(dá)影響細(xì)胞對γ射線敏感性的高低變化作出判斷： 2．根據(jù)PMA可在體外刺激培養(yǎng)的細(xì)胞近日鐘基因節(jié)律表達(dá)，結(jié)合第一部分的研究結(jié)果，首先在體外對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行擇時(shí)照射，選擇PMA刺激后腫瘤細(xì)胞內(nèi)mPer2節(jié)律表達(dá)的高峰與低谷的不同時(shí)間給予腫瘤細(xì)胞γ射線照射，通過克隆形成、細(xì)胞增

5、殖核抗原免疫組化觀察細(xì)胞生長、增殖以及通過單細(xì)胞凝膠電泳觀察不同時(shí)間照射組細(xì)胞DNA損傷的情況；體內(nèi)研究，采用授時(shí)因子發(fā)生儀對荷瘤小鼠進(jìn)行光暗周期程控調(diào)控，在腫瘤組織mPer2表達(dá)的峰值與谷值給予小鼠<'60>Co-γ射線照射，觀察不同時(shí)間照射組腫瘤生長的抑制情況，腫瘤組織石蠟切片HE染色以及PCNA免疫組化觀察不同時(shí)間照射組腫瘤組織細(xì)胞的形態(tài)及增值情況，通過體重、生存曲線觀察不同時(shí)間照射組小鼠的毒副反應(yīng)程度； 3．通過流式細(xì)胞

6、術(shù)檢測不同組細(xì)胞受射線照射后細(xì)胞周期阻滯及凋亡，通過單細(xì)胞凝膠電泳檢測不同組細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況，以及通過分子生物學(xué)方法RT-PCR了解凋亡相關(guān)基因p53、bcl-2、bax、c-myc以及DNA損傷修復(fù)基因Rad51在不同組細(xì)胞的表達(dá)變化，探討節(jié)律基因mPer2對細(xì)胞γ射線損傷敏感性變化的分子作用機(jī)制。 結(jié)果： 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法成功將構(gòu)建好的mPer2基因重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-mPer2轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)

7、胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70％以上，通過克隆形成率擬合生存曲線得到放射生物學(xué)參數(shù)Do、Dq值mPer2轉(zhuǎn)染組較對照組高，外推數(shù)N值變小，單細(xì)胞凝膠電泳顯示mPer2轉(zhuǎn)染組拖尾率（彗星細(xì)胞出現(xiàn)率）及尾長均較對照組低，提示mPer2高表達(dá)使細(xì)胞對射線損傷的敏感性降低；通過PMA刺激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞mPer2節(jié)律表達(dá)，在其表達(dá)的高峰與低谷的不同時(shí)間進(jìn)行照射，細(xì)胞同樣表現(xiàn)出上述趨勢，對程控光照的荷瘤小鼠進(jìn)行不同時(shí)間照射，PCNA免疫組化顯示，mPer2高表

8、達(dá)組較低表達(dá)組腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞增值較明顯；雖然兩組小鼠體重及生存期沒有明顯差異，但mPer2表達(dá)高峰組腫瘤抑制不如表達(dá)低谷組，表達(dá)低谷組在照射后表現(xiàn)出明顯再生長延緩；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，mPer2高表達(dá)組照射后細(xì)胞出現(xiàn)明顯G2／M期阻滯，凋亡率較低，單細(xì)胞凝膠電泳顯示損傷后1小時(shí)mPer2高表達(dá)組細(xì)胞DNA即出現(xiàn)明顯修復(fù)，RT-PCR表明，mPer2高表達(dá)組顯示細(xì)胞受照射后較對照組修復(fù)基因mRad51表達(dá)增高，p53增高不如對照組明顯

9、、bax表達(dá)明顯降低，bcl-2，c-myc表達(dá)明顯增加，bcl-2/bax比值增加。 結(jié)論： 細(xì)胞內(nèi)mPer2高表達(dá)可降低細(xì)胞對<'60 > Co-r射線損傷的敏感性，使細(xì)胞存活比率增加，流式細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞凝膠電泳、RT-PCR檢測分析表明mPer2高表達(dá)使照射后細(xì)胞周期阻滯于G2/M期以提供給DNA損傷修復(fù)的時(shí)機(jī)，同時(shí)增加修復(fù)基因、降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá)是其分子作用機(jī)制所在。進(jìn)一步對體外、體內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行擇時(shí)放療，證