家蠶Bm12細(xì)胞中綠僵菌素A結(jié)合蛋白的初步研究.pdf

1、綠僵菌素A（DA）是由金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae產(chǎn)生的一種環(huán)縮羧肽類次生化合物，具有殺蟲、抗病毒等生物活性，但是其作用機(jī)理尚不清楚。分離鑒定綠僵菌素A結(jié)合蛋白，明確其分子組成與結(jié)構(gòu)及其與其他蛋白的相互作用關(guān)系，才能從根本上認(rèn)識(shí)綠僵菌素A的分子作用機(jī)理。因此，本研究以家蠶Bombyx mori Bm12細(xì)胞為材料，利用酶解和電泳技術(shù)分離DA結(jié)合蛋白，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)初步鑒定DA結(jié)合蛋白，通過(guò)同源建模和分子對(duì)接評(píng)估

2、這些蛋白與DA結(jié)合作用；最后采用RNAi技術(shù)沉默相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，明確DA處理或沉默TOLL和IMD信號(hào)通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子后家蠶抗菌肽cecropin B和gloverin4基因以及BmRel/BmRelish基因表達(dá)的變化。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）綠僵菌素A結(jié)合蛋白的分離與鑒定
　　用200μg/mL DA處理Bm12細(xì)胞6h后，提取總蛋白質(zhì)，然后分別用鏈蛋白酶與蛋白酶K降解所提取的蛋白

3、1、3、5 min，再進(jìn)行電泳分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K降解后，DA處理的細(xì)胞與對(duì)照相比，增加三個(gè)電泳條帶（A、B1、B2）；而鏈蛋白酶降解的蛋白則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異條帶。進(jìn)而，將這些差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，分析發(fā)現(xiàn)A、B1、B2三個(gè)條帶中相同的蛋白質(zhì)有112種，分子質(zhì)量介于50~100 KDa之間。
　?。?）綠僵菌素A結(jié)合蛋白的同源建模與分子對(duì)接
　　從上述112種選取得分較高的26個(gè)蛋白，采用MOE2014.09軟件對(duì)其進(jìn)行

4、同源建模和分子對(duì)接分析。結(jié)果顯示：26個(gè)蛋白與 DA對(duì)接的自由能介于-9.93~-5.46 kcal/mol之間，尤其是其中7種蛋白其對(duì)接自由能小于-8.00 kcal/mol，顯示出與DA具有良好的結(jié)合效果。該26種蛋白功能涉及基因表達(dá)調(diào)控、分子伴侶、蛋白降解、蛋白合成和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白等，其中基因表達(dá)調(diào)控蛋白6種，分子伴侶5種，蛋白降解酶4種，蛋白合成相關(guān)蛋白3種，細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白3種，能量代謝相關(guān)蛋白2種，免疫功能相關(guān)蛋白1種，跨膜運(yùn)輸相

5、關(guān)蛋白1種，以及功能未知蛋白1種。
　?。?）綠僵菌素A對(duì)家蠶抗菌肽cecropin B和gloverin4基因表達(dá)的影響
　　DA能引起抗菌肽cecropin B基因表達(dá)上調(diào)和gloverin4基因表達(dá)下調(diào)。利用特異性siRNA分別沉默轉(zhuǎn)錄因子基因BmRelish1、BmRelish2、BmRel后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)單獨(dú)沉默轉(zhuǎn)錄因子BmRelish2基因時(shí)，cecropin B和gloverin4基因表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明這兩種抗菌肽的合成

6、均通過(guò)IMD信號(hào)通路調(diào)控。當(dāng)沉默BmRelish1或BmRel基因及DA處理聯(lián)合作用時(shí)，cecropin B基因顯著下調(diào)，說(shuō)明在抑制cecropin B的合成時(shí)，DA與轉(zhuǎn)錄因子BmRelish1或者BmRel之間存在密切的協(xié)同效應(yīng)；同樣，在促進(jìn)gloverin4的合成時(shí)，DA與轉(zhuǎn)錄因子BmRelish2之間也存在著協(xié)同效應(yīng)。
　　（4）綠僵菌素A影響轉(zhuǎn)錄因子BmRel/BmRelish調(diào)控基因表達(dá)
　　考察了DA對(duì)上述轉(zhuǎn)錄因

7、子調(diào)控Bm045、Bm066和Bm133基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bm045和 Bm066基因表現(xiàn)相似，當(dāng)單獨(dú)沉默BmRelish1基因或者DA處理時(shí)，兩個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)，當(dāng)沉默BmRelish1基因和DA處理聯(lián)合作用時(shí)，都上調(diào)表達(dá)；單獨(dú)沉默BmRelish2基因時(shí)，Bm045和 Bm066基因表達(dá)上調(diào)，但是，沉默BmRelish2基因和DA處理聯(lián)合作用時(shí)，都下調(diào)表達(dá)；沉默BmRel基因和DA聯(lián)合作用則不能引起這兩個(gè)基因表達(dá)的變化。對(duì)于Bm