模擬高原低氧環(huán)境對兔牙周炎致病菌影響的實驗研究.pdf

1、目的及意義：
　　 高原地區(qū)自然環(huán)境惡劣，大氣壓低、氧分壓低、寒冷、風大、輻射強等，嚴重影響人們的口腔和全身健康。國內大量研究[1-2]顯示高原地區(qū)牙周病的發(fā)病率及病程進展速度遠高于平原地區(qū)。但目前的研究多停留在流行病學調查層面，僅對此臨床現(xiàn)象有一定認識，對其發(fā)生、發(fā)展的病理生理特點及發(fā)病機制仍缺乏足夠的研究和認識，影響臨床防治效果。
　　 菌斑細菌是牙周病的始動因子。牙周致病菌以厭氧菌為主，其發(fā)生發(fā)展與宿主防御機制、細

2、菌之間相互作用、細菌在牙周定植的數(shù)量水平等諸多因素有關[3]。由于牙周局部生態(tài)環(huán)境和牙周微生物生態(tài)關系的復雜性，以及技術上的障礙，很多問題仍然沒有完全闡明。本課題組在前期研究中，通過PCR-變形梯度凝膠電泳技術(polymerase chainreaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)發(fā)現(xiàn)，模擬高原低氧環(huán)境下SD大鼠牙周炎致病菌具有多樣性，且與平原牙周炎致病菌種類

3、存在顯著差異。由此我們推測，高原低壓、低氧的特殊環(huán)境會影響口腔微生物，尤其是牙周厭氧菌在齦袋的選擇性定植，其數(shù)量及內毒素水平存在差異。
　　 本實驗模擬高原低氧環(huán)境建立兔牙周炎動物模型后，采用厭氧菌的分離、培養(yǎng)、鑒定及內毒素檢測等技術對不同條件下兔齦下菌斑中定植的細菌種類、數(shù)量及內毒素水平，以及兔齦溝液pH值、活菌數(shù)、內毒素水平與牙周臨床指標的相關性作初步探討，并對牙周主要致病厭氧菌，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas

4、gingivalis，Pg)在不同條件下兔齦下菌斑中的檢出率及內毒素水平作相關研究，驗證實驗假設，進一步豐富高原牙周病微生物學的基礎研究。
　　 方法及步驟：
　　 1、40只雄性大白兔隨機分為4組(平原對照組、平原實驗組、高原對照組及高原實驗組)，每組10只，實驗組聯(lián)合正畸絲結扎兔雙下頜中切牙及牙周炎食譜飼養(yǎng)的方法建立牙周炎模型，高原組送入低壓氧艙內飼養(yǎng)(模擬海拔高度5000m，23h/d)，平原組在平原環(huán)境下飼養(yǎng)(重

5、慶，平均海拔400m)。
　　 2、建模8周后檢測各組兔附著喪失(attachment loss，AL)，并記錄菌斑指數(shù)(plaqueindex，PLI)和牙齦指數(shù)(gingival index，GI)；pH試紙檢測兔齦溝液pH值；拍攝兔下頜前牙X線片觀察牙槽骨吸收情況；切取牙周組織標本，采用HE染色觀察組織病理改變。
　　 3、采集兔雙下頜中切牙牙周袋內齦下菌斑，進行厭氧菌的分離、培養(yǎng)、計數(shù)、鏡檢、內毒素檢測，分析牙周

6、臨床指標與兔齦溝液pH值、活菌數(shù)及內毒素水平的相關性。
　　 4、從成功培養(yǎng)出的牙周厭氧菌中分離、培養(yǎng)、鑒定Pg，并比較各組Pg的檢出率及內毒素水平。
　　 研究結果：
　　 一、動物模型的實驗結果：
　　 1、組織病理學觀察：平原對照組及高原對照組齦溝內上皮無病理性改變，牙周膜纖維排列整齊，細胞排列有序，牙槽嵴無吸收，牙槽骨無破壞；平原實驗組齦溝內上皮出現(xiàn)糜爛，大量炎癥細胞浸潤，牙周膜間隙增寬，牙槽骨少

7、量破壞；高原實驗組齦溝內上皮出現(xiàn)糜爛，可見大量炎癥細胞如中性粒細胞、淋巴細胞等浸潤，牙周膜間隙增寬，牙周膜纖維排列紊亂或斷裂，可見牙槽嵴水平降低。
　　 2、X線片觀察：平原對照組及高原對照組牙周膜間隙未見明顯異常，牙槽嵴頂未見明顯吸收；平原實驗組及高原實驗組可見牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂吸收，呈不規(guī)則降低，其中以高原實驗組更為嚴重。
　　 3、各項牙周臨床指標檢測：高原實驗組AL、PLI、GI均高于其余各組，且與平原實驗

8、組比較有顯著差異(P<0.01)。
　　 二、厭氧菌分離、培養(yǎng)的實驗結果：
　　 1、兔牙周厭氧菌經革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，平原組齦下菌斑中細菌種類單一，主要以G-桿菌及球菌為主，而高原組細菌種類則較為豐富，G-桿菌、球菌，G+桿菌、球菌均占一定比例。
　　 2、高原實驗組兔齦溝液pH值、活菌數(shù)及內毒素水平均高于其余各組，且與平原實驗組比較有顯著差異(P<0.05)。
　　 3、齦溝液pH值

9、、活菌數(shù)與AL、PLI、GI有一定的相關性，呈正相關(P<0.01)；內毒素水平與AL呈正相關(P<0.01)，與PLI、GI無相關性(P>0.05)。
　　 三、Pg分離、培養(yǎng)的實驗結果：
　　 1、Pg在CDC血平板上純化培養(yǎng)5d后，可形成直徑約1-2mm菌落，棕色或黑色，呈凸起狀，表面光滑，似金屬光澤，邊緣整齊，完全溶血；革蘭氏染色后光學顯微鏡下觀察，Pg為G-桿菌或球桿菌，染色不均。
　　 2、除平原對照

10、組外，其余三組均成功檢出Pg；與平原實驗組比較，高原實驗組中Pg的檢出率及內毒素水平均有顯著差異(P<0.05)。
　　 研究結論：
　　 1、本研究成功建立了兔高原及平原牙周炎模型，各項結果顯示高原實驗組與平原實驗組在臨床表現(xiàn)、牙周臨床指標及牙周菌群等方面均存在顯著差異，證實高原低壓低氧的特殊環(huán)境加快了牙周炎的進展速度，加重了炎癥的破壞程度。
　　 2、高原低壓低氧的特殊環(huán)境更有利于G-厭氧菌的定居，使得牙周袋