重組人凋亡素2配體Ⅰ期臨床及相關實驗研究.pdf

1、凋亡素2配體(Apo-2 ligand，Apo2L)，或稱腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAlL)，是近年來發(fā)現的腫瘤壞死因子家族新成員，它通過與細胞表面相應的死亡受體相結合，啟動凋亡的信號傳導，能選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常組織無明顯損傷，因而成為目前細胞凋亡領域抗腫瘤藥物的研究熱點?；贏po2L／TRAlL獨特的作用

2、機制、重組人可溶性Apo2L／TRAlL臨床前體現出的廣譜的抗腫瘤作用和良好的安全性、以及內源性血管生成抑制因子抗腫瘤研究進展，本課題開展了下述兩方面的研究：①國產重組人凋亡素2配體(rh-Apo2L)的Ⅰ期臨床研究；②人Apo2L／TRAlL與人血管生成抑制因子融合表達的基礎研究。 第一部分：重組人凋亡素2配體(rh-Apo2L)的Ⅰ期臨床研究 目的：觀察晚期惡性腫瘤病人對rh-Apo2L靜脈滴注后的耐受性；測定該藥在

3、人體的藥代動力學主要參數；初步觀察其抗腫瘤療效；提出Ⅱ期臨床研究合理的劑量及方案。方法：符合招募標準并簽署知情同意書的晚期惡性腫瘤志愿者，首先接受rh-Apo2L皮試，皮試陰性者才能接受rh-Apo2L治療：按“3+3”原則進行劑量爬坡，每組3～6例。研究方案為，rh-Apo2L溶于250毫升0.9％生理鹽水中，靜脈滴注2小時，每天一次，連用14天(d)，觀察14天，28天為一周期。根據耐受性研究結果，選擇患者取血清采用“Sandwic

4、h ELISA”方法，進行單次或連續(xù)給藥的藥代動力學研究。結果：入組患者22例，2例皮試陽性退出研究，20例完成劑量爬坡和耐受性研究。rh-Apo2L給藥由10μg／kg／d爬坡至300μg／kg／d共6個劑量組，具體為10μg／kg／d、30μg／kg／d、100μg／kg／d、150μg／kg/d、200μg／kg／d、300μg／kg／d。 耐受性研究顯示，rh-Apo2L，的毒性反應輕微。除300μg／kg／d劑量組出現

5、度全身炎性反應綜合征，其余均為Ⅰ～Ⅱ度不良反應，包括發(fā)熱、疲勞、乏力、皮膚粘膜改變、消化道反應、心血管系統(tǒng)毒性、骨髓抑制和肝腎功能損傷。所有毒副反應均在停藥2周內恢復。未出現過敏性休克和藥物相關死亡。19例可評價療效，13例(68％)為穩(wěn)定，6例(32％)為進展。四個劑量水平(30μg／kg／d、100μg／kg／d、150pg／kg／d、200μg／kg／d)共18例次患者，進行了單次或連續(xù)給藥的藥代動力學研究。結論：rh-Apo2L

6、靜脈滴注后的耐受性良好，劑量限制性毒性(DLT)是全身炎性反應綜合征；最大耐受劑量(MTD)為200μg／kg／d；rh-Apo2L靜脈滴注符合二室模型藥動學分布特性和線性動力學特征。Ⅱ期臨床研究推薦方案為150μg／kg／dx14d(該劑量水平已超過動物實驗中顯示出的有效劑量)，28天為一周期。 第二部分：人Apo2L／TRAIL與人血管生成抑制因子融合表達的研究 目的：將不同來源的內源性血管生長抑制因子——人凝血系統(tǒng)

7、分子kininogen來源的片斷kininostatin、人細胞內蛋白caketiculin來源的片斷vasostatin及人Ⅳ型膠原α2鏈C末端來源的canstatin，分別與人Apo2L／TRAIL進行融合表達，通過初步生物學活性觀察，從中篩選出雙功能蛋白——即特異地抑制腫瘤組織新生血管形成和殺傷腫瘤細胞的分子。方法：實驗根據內源性血管生長抑制因子kininostatin、vasostatin、canstatin與Apo2L／TRA

8、IL的編碼序列，設計相應引物；分別以包含這些分子的編碼序列的質粒為模板，用兩輪聚合酶鏈反應(PCR)(即SOEing法)擴增出通過氨基酸連接臂(Linker，氨基酸序列為GGGSGGSG)連接的編碼融合蛋白的DNA序列；相應的融合基因插入原核表達載體pBV220中，得到各融合蛋白重組表達質粒；將構建的重組質粒轉化大腸桿菌BL21，篩選出含重組質粒的克隆，42℃熱誘導表達，獲得一系列融合蛋白：A-K(Apo2L-Kininostatin)

9、，K-A(Kininostatin-Apo2L)，A-V(Ap02L-Vasostatin)，V-A(Vasostatin-Apo2L)，A-C(Apo2L-Canstatin)，C-A(Canstatin-Apo2L)；分析、鑒定和純化所表達的重組融合蛋白后，通過腫瘤細胞株SW1990和NCI-H460的殺傷實驗、內皮細胞ECV304增殖抑制實驗、以及ECV304細胞管腔形成抑制實驗，分析融合蛋白的生物學活性，以篩選出具有最強抗腫瘤作

10、用的雙功能的分子。結果：6種融合蛋白在原核表達系統(tǒng)中都得到了表達；K-A(Kininostatin-Apo2L)和V-A(Vasostatin-Apo2L)融合蛋白基本保持著Apo2L／TRAIL殺傷腫瘤細胞的活性；融合蛋白也增強了Apo2L／TRAIL對ECV304的殺傷作用，從而確定了融合蛋白中血管生長抑制因子的生物學活性；通過管腔形成實驗也證實了K-A、V-A的新生血管生長抑制作用。結論：本部分工作，在原核表達系統(tǒng)中高效重組表達了