Apelin-13動(dòng)態(tài)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡信號(hào)通路保護(hù)心肌缺血灌注損傷及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)是多種原因?qū)е麓罅磕┱郫B、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量堆積，擾亂了正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)并誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激早期，．細(xì)胞通過(guò)相應(yīng)的未折疊的蛋白質(zhì)信號(hào)反應(yīng)以清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積過(guò)多未成熟蛋白以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。然而，在持久的和/或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路就被激活并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了哺乳動(dòng)物的各種病理生理過(guò)

2、程。在心血管系統(tǒng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了包括心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、動(dòng)脈硬化等病理生理過(guò)程。
　　 Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的配體，Apelin/APJ信號(hào)通路通過(guò)拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，PASS)發(fā)揮心肌保護(hù)作用，并可明顯改善心肌功能。表明其具有重要的生物學(xué)效應(yīng)。本研究利用大鼠心臟在體缺血再灌注模型，旨在研究：1）進(jìn)一步闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

3、信號(hào)通路動(dòng)態(tài)改變與心肌缺血再灌注損傷的程度密切相關(guān)；2）Apelin通過(guò)改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及抑制其相應(yīng)的凋亡信號(hào)通路而減少再灌注損傷、減少心肌梗死面積：3）初步探討PI3k/Akt，ERK1/2，AMPK以及eNOS信號(hào)通路在apelin心肌保護(hù)作用機(jī)理中的價(jià)值。
　　 第一部分、時(shí)相依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路激活導(dǎo)致缺血再灌注損傷心肌梗死面積的動(dòng)態(tài)改變
　　 目的：既往研究大多關(guān)注缺血再灌注損傷心肌梗死早期（某一時(shí)間點(diǎn)）改變

4、，而未能進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察研究動(dòng)態(tài)變化及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激間的相互關(guān)聯(lián)。為此本研究旨在動(dòng)態(tài)觀察再灌注時(shí)相2h，12h以及24h的心肌梗死面積以及ER Stress相關(guān)信號(hào)通路的活性變化。
　　 方法：建立在體大鼠缺血再灌注模型，即冠脈缺血30分鐘后，將大鼠分為：IR2小時(shí)組、IR12小時(shí)組、IR24小時(shí)組：另設(shè)一組IRO小時(shí)組和假手術(shù)組（共5組）。分別觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物活性改變、心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積變化。
　　 結(jié)果：隨

5、著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌梗死面積逐漸增加，缺血30分鐘，心肌梗死面積從再灌注2小時(shí)的34.85±6.52％上升到12小時(shí)的48.98±16.22%，而從IR12小時(shí)到24小時(shí)心肌梗死面積無(wú)明顯增加(48.98±3.35% vs.50.56±3.24%)。與心肌梗死面積的增加相伴隨的是從再灌注2小時(shí)到12小時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP的表達(dá)、caspase-12和JNK的活性顯著增加，分別增加了2.49倍、3.38倍和2.09倍（P分別<0

6、.05）；梗死周邊區(qū)caspase3的活性和凋亡心肌細(xì)胞百分比也分別比2小時(shí)增加了2.6倍和2.5倍（P分別<0.05）。相反，ER Stress相應(yīng)的凋亡信號(hào)通路CHOP、caspase-12和JNK的活性，caspase3活性和凋亡心肌細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在IR24小時(shí)卻較IR12小時(shí)下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：1．缺血再灌注損傷心肌梗死面積呈時(shí)間依賴性的動(dòng)態(tài)變化：2．該心肌梗死面積變化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡信號(hào)通路激活相關(guān)。<

7、br>　　 第二部分、Apelin通過(guò)改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少缺血再灌注損傷心肌梗死面積
　　 目的：既往研究表明Apelin/APJ信號(hào)通路參與了缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)，本研究旨在研究apelin是否通過(guò)改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)揮缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)。
　　 方法：通過(guò)在體結(jié)扎心臟左冠脈前降支，30分鐘恢復(fù)冠脈血流建立在體大鼠缺血再灌注模型。1）將大鼠分為單純?nèi)毖俟嘧p傷組(IRI)：2)IRI大鼠給予小劑量apelin

8、(0.1ug/Kg)組；3）IRI大鼠給予中等劑量apelin(lug/Kg)組；4）IRI大鼠給予大劑量apelin(lOug/Kg)組。于再灌注2小時(shí)分別測(cè)定心肌梗死面積，描述apelin心肌保護(hù)作用的劑量依賴性藥理效應(yīng)。
　　 選擇最佳a(bǔ)pelin劑量，將缺血再灌注大鼠分為：1）IRI組和2）IRl+apelin組。兩組大鼠分別于IR2小時(shí)、12小時(shí)、IR24小時(shí)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78表達(dá)和ER Stress相關(guān)信

9、號(hào)通路的活性變化、梗死周邊區(qū)凋亡心肌細(xì)胞和心肌梗死面積變化。另設(shè)一假手術(shù)組在再灌注2小時(shí)觀察相同指標(biāo)。
　　 結(jié)果：1）apelin保護(hù)再灌注損傷心肌呈劑量依賴性，即1ug/Kg劑量保護(hù)心肌作用明顯好于0.1ug/Kg組和lOug/Kg組；2）該劑量組apelin不僅減少了再灌注2小時(shí)的心肌梗死面積(35.26±2.45% vs.IRI組，18.96±2.68%;P

10、6±3.05% vs.IRI組，24.01±3.50%P<0.05)：同時(shí)，與IRI組相比較apeIin完全抑制了在再灌注2小時(shí)時(shí)CHOP、caspase-12和JNK的激活，也明顯抑制了這些ER Stress相關(guān)的凋亡信號(hào)通路活性在12和24小時(shí)進(jìn)一步增高，這一保護(hù)作用與梗死周邊區(qū)caspase-3活性以及凋亡心肌細(xì)胞百分比改變一致。
　　 結(jié)論：1.apelin保護(hù)缺血再灌注損傷心肌呈劑量依賴性，即lug/Kg顯示最佳療效；

11、2.apelin通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路在2小時(shí)完全抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而保護(hù)心肌，在再灌注24小時(shí)仍然明顯改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因而可減少心肌梗死面積的增加。
　　 第三部分、PI3K/Akt，ERK，AMPK以及eNOS信號(hào)通路參與了apeIin調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)調(diào)往信號(hào)通路而減少心肌缺血再灌注損傷
　　 目的：PI3K/Akt，ERK，AMPK以及eNOS信號(hào)通路激活可保護(hù)心肌，本研究旨在探討這些信號(hào)通路是否參與ap

12、elin調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路以減輕缺血再灌注損傷。
　　 方法：將心肌缺血再灌注的大鼠分為：假手術(shù)組、對(duì)照組、apelin干預(yù)組；另有IR對(duì)照和IR+apelin組分別給予LY294002(IR+LY294002和IR+apelin+LY294002)、PD98059(IR+ PD98059和IR+apelin+PD98059)、Compound C(IR+CompoundC和IR+apelin+Compou ndC)和L-N

13、AME(IR+ L-NAME和IR+apelin+L-NAME)治療以分別阻斷Akt、ERK、AMPK和eNOS活性，驗(yàn)證他們?cè)赼pelin治療機(jī)理中的作用價(jià)值。
　　 結(jié)果：1）在缺血/再灌注30分鐘，apelin增加了P-Akt,P-ERK、P-AMPK、P-eNOS的活性；2）LY294002和Compound C均抑制了P-Akt、AMPK、P-eNOS的激活，而不影響ERK活性：而L-NAME和PD98059則分別抑制

14、了P-eNOS、P-ERK的活性，但對(duì)Akt、AMPK活性沒(méi)有明顯影響；3）Akt、AMPK、eNOS、ERK的抑制劑均可以完全阻斷apelin在灌注損傷2小時(shí)的保護(hù)作用，并出現(xiàn)心肌梗死面積范圍逆轉(zhuǎn)：而在再灌注24小時(shí)時(shí)apelin減少心肌梗死面積的保護(hù)現(xiàn)象也可部分被這些阻斷劑所阻斷：4）這些時(shí)相依賴性反應(yīng)的變化和再灌注時(shí)相2小時(shí)和24小時(shí)apelin對(duì)CHOP、caspase-12和JNK的活性調(diào)控作用相符合。
　　 結(jié)論：1