抗EGFR納米抗體的制備及其活性研究.pdf

1、抗表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的納米抗體由于具有相比普通單克隆抗體更優(yōu)異的溶解性、穩(wěn)定性、滲透性和易于融合表達(dá)并且獲得多價(jià)抗體等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的臨床診斷和治療方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而，大規(guī)模獲得有活性的抗EGFR納米抗體仍然是目前研究中的難點(diǎn)，是其廣泛應(yīng)用的重要制約因素。本研究通過(guò)進(jìn)行基因序列改造、誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化獲得了高純度的5種抗EGFR納米抗體的包涵體，隨后

2、通過(guò)優(yōu)化包涵體的復(fù)性條件顯著提高了納米抗體的產(chǎn)率。又通過(guò)綜合評(píng)價(jià)復(fù)性納米抗體的結(jié)合活性和癌癥細(xì)胞表面受體識(shí)別能力證實(shí)了獲得的納米抗體具有高活性。論文的研究?jī)?nèi)容包括:
　　(1)抗EGFR納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá):通過(guò)基因工程技術(shù)，在大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) BL21(DE3)中進(jìn)行了5種抗EGFR納米抗體的原核表達(dá)。通過(guò)比較誘導(dǎo)劑IPTG的加入濃度，加入時(shí)間及誘導(dǎo)時(shí)間，最終確定納米抗體的最佳表達(dá)條件為37

3、℃，IPTG加入時(shí)間為菌種開(kāi)始培養(yǎng)4h后，加入量為0.4 mM，誘導(dǎo)表達(dá)4h，最終可使抗EGFR納米抗體的表達(dá)量占總蛋白的25％。通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行目的蛋白的可溶性檢測(cè)得知，表達(dá)的納米抗體主要以包涵體形式存在。
　　(2)抗EGFR納米抗體的分離純化及包涵體復(fù)性:本研究通過(guò)在抗EGFR納米抗體C端加入6個(gè)His標(biāo)簽，并使用金屬離子螯合層析法，梯度增強(qiáng)咪唑濃度(100 mM咪唑、300 mM咪唑)洗脫，顯著提高了抗EGFR納米

4、抗體的純度，5種納米抗體的最終純度均在90％以上。通過(guò)使用Bradford法和細(xì)胞Elisa對(duì)透析復(fù)性和稀釋復(fù)性的可溶性蛋白收率和納米抗體活性進(jìn)行了比較評(píng)價(jià)，最終采用稀釋復(fù)性的方法，并進(jìn)一步對(duì)影響稀釋復(fù)性的6種參數(shù)（初始蛋白濃度、稀釋液滴加速率、復(fù)性pH、添加劑種類、精氨酸濃度、還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比例）進(jìn)行考察，確定最佳的稀釋復(fù)性條件為:初始蛋白濃度0.3-0.4 mg/mL，復(fù)性pH=8.0，添加200 mM精氨酸及比例為

5、5∶1的還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽，包涵體復(fù)性率為73％，納米抗體最終得率為38％。
　　(3)抗EGFR納米抗體活性評(píng)價(jià)及作用靶點(diǎn)研究:本研究通過(guò)使用細(xì)胞Elisa的方法評(píng)價(jià)了所獲得的5種納米抗體的結(jié)合活性，最終確定所獲得的5種抗EGFR納米抗體均具有抗原結(jié)合活性，并且納米抗體C活性最高。進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)和MTT法確認(rèn)了所獲得抗EGFR納米抗體能夠識(shí)別表皮癌細(xì)胞A431表面EGFR受體，并且能夠與EGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EG