抗p185單抗5E12Fab段基因的克隆及表達(dá).pdf

1、目的:克隆抗p185單抗5E12的Fab段基因,構(gòu)建其表達(dá)載體并在原核細(xì)胞進(jìn)行功能性表達(dá).方法:用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR),以可變區(qū)第一骨架區(qū)的通用引物從分泌抗p185單抗的雜交瘤細(xì)胞系5E12中克隆Fd段和κ鏈的基因,重組到Fab表達(dá)載體中,在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體抗體和可溶性Fab;根據(jù)前導(dǎo)肽序列設(shè)計(jì)引物,克隆抗p185的Fd段和κ鏈基因,獲得其氨基端原始序列;根據(jù)原始序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變將V區(qū)基因氨

2、基端序列恢復(fù)為5E12的原始序列;以NIH3T3/erbB-2細(xì)胞ELISA法、免疫組化法等進(jìn)行特異性鑒定.結(jié)果:以第一骨架區(qū)的通用引物從小鼠雜交瘤細(xì)胞5E12中克隆到Fd段和κ鏈的基因,在大腸桿菌中表達(dá)出Fab段但無(wú)特異性抗原結(jié)合活性;采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)建立噬菌體抗體庫(kù),反復(fù)篩選均未篩出陽(yáng)性克隆;分別將Fd段和κ鏈V區(qū)基因的氨基端序列矯正為親本單抗的原始序列后,終于得到可與轉(zhuǎn)染erbB-2基因的3T3/erbB-2細(xì)胞結(jié)合的小分子抗

3、體.通過(guò)比較突變前后Fab段的分泌表達(dá),發(fā)現(xiàn)無(wú)論輕鏈或重鏈可變區(qū)氨基端序列的變化均不影響Fab段的分泌量,而是影響了抗體和抗原的結(jié)合.單獨(dú)恢復(fù)重鏈可變區(qū)氨基端序列可恢復(fù)抗原結(jié)合活性.但同時(shí)恢復(fù)輕鏈后活性未見(jiàn)進(jìn)一步提高,反而有下降的趨勢(shì).提示在與抗原結(jié)合的過(guò)程中,重鏈的作用是主要的,同時(shí)輕鏈也可影響抗體與抗原的結(jié)合.結(jié)論:成功構(gòu)建了抗p185小分子抗體Fab的表達(dá)載體并進(jìn)行功能性表達(dá),為進(jìn)一步構(gòu)建抗抗p185鼠單抗其他小分子抗體及其人源化