SLIT2在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達及調(diào)控.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是婦科常見的良性疾病之一,在生育期婦女中發(fā)病率為10-15％,因其臨床表現(xiàn)多變,僅依據(jù)其臨床表現(xiàn)往往不能確診,故EM的實際發(fā)病率甚至更高。EM以痛經(jīng)、不孕、性交痛等臨床癥狀為特征,嚴重影響了患病婦女的生活質(zhì)量。
　　EM的病因目前尚不清楚。目前多數(shù)學者認可Sampson的種植學說。根據(jù)此學說,異位病灶在形成和生長過程中需要氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應。研究表明,新生血管生成是EM的重要特征。而

2、目前對EM新生血管生成的機理了解尚不透徹。
　　EM治療目前以手術(shù)和藥物治療為主,手術(shù)有較高的復發(fā)率,而藥物治療存在藥物副作用及停藥癥狀復現(xiàn)等問題。由于EM對血管生成高度依賴,近年來EM抗血管生成治療開始得到關注。在抗血管生成治療的研究中,以VEGF-A為靶點的藥物研究得最多,但發(fā)現(xiàn)藥物遠期療效不佳,提示血管生成可能通過其他途徑發(fā)生了代償。
　　近年來研究表明,多種腫瘤細胞表達一種大分子蛋白SLIT2。體外實驗證實這種大分子

3、蛋白能通過與臍靜脈內(nèi)皮細胞上的ROBO1受體結(jié)合從而誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞定向運動,動物體內(nèi)實驗證明該分子SLIT2能促進腫瘤新生血管生成。由于子宮內(nèi)膜異位癥在生物學行為上類似惡性腫瘤,且對血管生成高度依賴,故SLIT2極有可能也在異位內(nèi)膜病灶表達。SLIT2的表達同時也可以解釋抗血管生成治療研究中的耐藥問題,即在VEGF-A等已知途徑外尚存在其他血管生成機制,當阻斷VEGF-A后,極有可能通過其他血管生成途徑發(fā)生了代償,從而藥物療效不佳。

4、前期研究用免疫組織化學的方法已證明SLIT在異位內(nèi)膜中表達,與正常內(nèi)膜中的表達相比上調(diào),且其表達與微血管密度(MVD)密切相關。由于該免疫組化實驗中用到的抗體同時結(jié)合三種SLIT亞型,故哪一種或幾種亞型在異位灶中表達尚不清楚。由于間質(zhì)細胞在異位病灶的黏附、生長等過程中發(fā)揮了關鍵作用,故本研究擬從細胞水平研究異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中SLIT2及其受體ROBO1的表達,并探討可能的調(diào)控因素及調(diào)控機理。
　　第一部分:SLIT2在人異位內(nèi)膜間

5、質(zhì)細胞中的表達。
　　目的:檢測原代培養(yǎng)的異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中是否存在SLIT2 mRNA表達;若有表達,相對于正常婦女子宮內(nèi)膜來源的間質(zhì)細胞中SLIT2 mRNA的表達水平有無區(qū)別;探討SLIT2 mRNA表達在月經(jīng)周期中是否波動。
　　方法:用原代培養(yǎng)的方法獲得異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞;用RT-PCR方法檢測其中有無SLIT2 mRNA的表達;用相對定量Real-time PCR方法觀察SLIT2 mRNA表達在

6、月經(jīng)周期中是否波動;用相對定量Real-time PCR方法比較SLIT2 mRNA在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞中表達的高低。
　　結(jié)果:在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞中存在SLIT2、SLIT3、ROBO1、ROBO2 mRNA的表達,四者密切相關;SLIT2 mRNA水平在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中表達較高。SLIT2 mRNA表達在月經(jīng)周期中存在波動。
　　結(jié)論:SLIT2 mRNA在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中高表達。<

7、br>　　第二部分:調(diào)控異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中SLIT2表達的因素
　　目的:探討異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中SLIT2表達的調(diào)控因素。
　　方法:用相對定量Real-time PCR方法檢測不同濃度或作用時間時雌激素、孕激素或TNF-a對SLIT2 mRNA表達的影響;用Western blot方法檢測10-7mol/L雌激素、0.1ng/ml TNF-a對SLIT2蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:SLIT2表達受雌激素與TNF-a調(diào)

8、控,雌激素與TNF-a調(diào)控SLIT2mRNA表現(xiàn)出濃度依賴性,10-7mol/L17β-雌二醇與0.1ng/ml TNF-a顯著上調(diào)SLIT2 mRNA及蛋白水平。孕激素對SLIT2 mRNA調(diào)控不明顯。
　　結(jié)論:雌激素與TNF-a可調(diào)控異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中SLIT2 mRNA和蛋白表達。
　　目的:探討異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中雌激素調(diào)控SLIT2表達的機理。
　　方法:以雌激素受體拮抗劑ICI182780、PI3K/Akt

9、信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑Aktinhibitor IV和LY294002、eNOs抑制劑L-NAME分別作用于異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,用Western blot方法觀察其是否抵消雌激素誘導的SLIT2蛋白表達,以檢測雌激素上調(diào)SLIT2是否通過雌激素受體ER、PI3K/Akt信號通路及其下游的eNOs信號通路介導;分別以Era和Erβ特異性激動劑PPT和DNP作用于異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,用Western blot方法觀察SLIT2表達是否上調(diào),以檢測介

10、導雌激素上調(diào)SLIT2的ER受體亞型;以Akt過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,用Western blot方法觀察SLIT2表達是否上調(diào),以檢測Akt是否介導SLIT2表達。
　　結(jié)果:1μM ICI182780、l00nM Akt inhibitorⅣ、10μM LY294002、500μM L-NAME均明顯下調(diào)異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中本底的SLIT2、ROBO表達及10-7mol/L17β-雌二醇誘導的SLIT2、ROBO1表達。E