H-,2-S通過(guò)調(diào)節(jié)NOS2和HO-1表達(dá)在小鼠CVB3心肌炎中起心肌保護(hù)作用.pdf

1、目的:探討硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)在小鼠柯薩奇病毒B3(Coxsackie virusesB3,CVB3)心肌炎中的作用及機(jī)制。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)選取清潔級(jí)近交系4-6周齡雄性Balb/C小鼠70只,隨機(jī)分為四組:心肌炎陰性對(duì)照組(N組,10只)、心肌炎陽(yáng)性對(duì)照組(C組,20只)、心肌炎干預(yù)組(P組和S組,各20只)。C、P、s組分別在第0天每只小鼠腹腔注射0.1m110-5.69 TCID50/ml的

2、CVB3制作心肌炎模型,N組從第0天起每只小鼠每日腹腔注射不含病毒的等量滅菌PBS液,此后P或S組于從第0天起予以炔丙基甘氨酸(DL-proparglygylcine，PAG)40mg/kg/d或硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)50μmol/kg/d腹腔注射,C組對(duì)應(yīng)予以等量磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)觀(guān)察記錄至接種第10天各組隨機(jī)取10只小鼠,記錄

3、小鼠體重和心臟重量,處死后留取心臟標(biāo)本檢測(cè)。Reed-Muench法測(cè)定接種病毒滴度；Log-rank檢驗(yàn)對(duì)心肌炎各組間進(jìn)行生存率的比較；蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色后光鏡觀(guān)察心肌組織病理學(xué)改變及并采用Rezkalla法計(jì)算炎癥積分；應(yīng)用免疫組化法(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine garnmalyase,CSE)、誘生型一氧化氮合

4、酶(induci ble nitric oxide synthase,NOS2)和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表達(dá)的分布含量,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polyrmerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)CSEmRNA，NOS2mRNA，HO-1mRNA含量,免疫蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)CSE蛋白、NOS2蛋白含量。
　

5、　 結(jié)果:
　　 1.小鼠一般情況和和生存曲線(xiàn)比較:接種病毒小鼠出現(xiàn)倦怠,聳毛,蜷縮在一起,腹瀉,進(jìn)行性體重下降,死亡；而未接種病毒小鼠健康活潑,體重逐漸增加,無(wú)小鼠死亡。接種病毒后第5天開(kāi)始,C組、P組出現(xiàn)死亡,第6天開(kāi)始S組出現(xiàn)死亡,至第10天C、P、S組分別死亡8、11、6只。Log-rank檢驗(yàn)C、P、S組之間小鼠生存率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2.心肌病理改變:N組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)炎性細(xì)

6、胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞死亡；C組心肌出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)水腫,血管充血,心肌腫脹壞死；P組心肌有廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌組織的壞死；S組心肌有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),壞死心肌區(qū)域小。
　　 3.心肌炎癥積分比較:N組心肌無(wú)炎性改變組織壞死,P組積分顯著高于C組(P<0.05),S組積分顯著低于C組(P<0.05)。
　　 4.心肌/體重比的比較:用心肌重與體重比值反映心肌水腫程度。病毒感染組比值均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05),P組

7、比值顯著高于C組(P<0.05),S組比值顯著低于C組(P<0.05)。
　　 5.免疫組化檢測(cè)心肌組織CSE、NOS2、HO-1表達(dá)
　　 5.1心肌組織CSE蛋白平均吸光度(mean optical density,MOD)比較:N組在血管內(nèi)皮細(xì)胞上呈弱陽(yáng)性表達(dá),而C組在血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞上呈陽(yáng)性表達(dá),C組MOD值顯著高于N組(P<0.05)。
　　 5.2心肌組織NOS2蛋白MOD值比較:N組為陰性表達(dá)

8、,C組在心肌細(xì)胞上呈陽(yáng)性表達(dá),P組心肌上呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),S組有輕度陽(yáng)性表達(dá)。病毒感染組MOD值均顯著高于N組(P<0.05),P組MOD值顯著高于C組(P<0.05),S組MOD值顯著低于C組(P<0.05)。
　　 5.3心肌組織HO-1蛋白MOD值比較:N組陰性表達(dá),C組在心肌細(xì)胞上呈陽(yáng)性表達(dá),P組呈輕度陽(yáng)性表達(dá),S組呈陽(yáng)性表達(dá)。病毒感染組MOD值均顯著高于N組(P<0.05),P組MOD值顯著低于C組(P<0.05),S組M

9、OD值顯著高于C組(P<0.05)。
　　 6.RT-PCR檢測(cè)心肌組織CSEmRNA,NOS2mRNA,HO-1mRNA含量
　　 6.1心肌組織勻漿CSEmRNA條帶光密度比較:C組顯著高于N組(P<0.05)
　　 6.2心肌組織勻漿NOS2mRNA條帶光密度比較:N組弱表達(dá),C和P組條帶光密度值均顯著高于N組(P<0.05),P組條帶光密度值顯著高于C組(P<0.05),S組條帶光密度值顯著低于C組(P<

10、0.05)。
　　 6.3心肌組織勻漿HO-1mRNA條帶光密度比較:N組弱表達(dá),C和S組條帶光密度值均顯著高于N組(P<0.05),P組條帶光密度值顯著低于C組(P<0.05),S組條帶光密度值顯著高于C組(P<0.05)。
　　 7.Werstern blot檢測(cè)心肌組織CSE蛋白,NOS2蛋白含量
　　 7.1心肌組織勻漿CSE蛋白條帶光密度比較:C組顯著高于N組(P<0.05)
　　 7.2心肌組

11、織勻漿NOS2蛋白條帶光密度比較:N組弱表達(dá),感染組條帶光密度值均顯著高于N組(P<0.05),P組條帶光密度值顯著高于C組(P<0.05),S組條帶光密度值顯著低于C組(P<0.05)。
　　 8.相關(guān)性分析
　　 8.1小鼠心肌炎癥病理積分與NOS2免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度呈顯著正相關(guān)(r=0.674,P<0.05,n=24)
　　 8.2小鼠心肌炎癥病理積分與HO-1免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度呈顯著負(fù)