一氧化氮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞因子表達(dá)的影響及相關(guān)關(guān)系.pdf

1、研究目的 應(yīng)用LPS誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞表達(dá)iNOS，通過AG抑制iNOS的活性，調(diào)節(jié)OA滑膜細(xì)胞產(chǎn)生NO，檢測(cè)不同NO濃度下，OA滑膜細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)情況，并探討它們與NO之間的相關(guān)關(guān)系。 研究方法 1、采集髖、膝OA患者關(guān)節(jié)滑膜，體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞。用抗vimentin抗體作免疫組化染色，鑒定。LPS濃度分為4組分別為0、1、10、100mg/L組。20mg/LLPS加入4組濃度分別為0、0.1、1、10 mmol

2、/LAG，收集培養(yǎng)液上清液。測(cè)量不同濃度LPS誘導(dǎo)下培養(yǎng)上清液中iNOS的含量變化和同一濃度LPS加不同濃度AG培養(yǎng)上清液中NO的含量變化。 2、培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，分成4組：滑膜細(xì)胞空白；滑膜細(xì)胞+LPS 20mg/L；滑膜細(xì)胞+AG 1mmol/L；滑膜細(xì)胞+LPS 20ug/L+AG 1mmol/L。根據(jù)分組分別加入LPS和AG，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)液上清。檢測(cè)各組NO濃度。用液態(tài)蛋白芯片技術(shù)對(duì)上清液基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP

3、)-1.3.9進(jìn)行檢測(cè)。了解NO濃度對(duì)OA滑膜細(xì)胞MMP-1.3.9表達(dá)的影響，并推測(cè)它們與NO之間的相關(guān)關(guān)系。 3、培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，分成4組：滑膜細(xì)胞空白；滑膜細(xì)胞+LPS 20mg/L；滑膜細(xì)胞+AG 1mmol/L；滑膜細(xì)胞+LPS 20ug/L+AG 1mmol/L。對(duì)不同分組的OA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)各組NO濃度。用液態(tài)蛋白芯片技術(shù)對(duì)上清液IL-6、TGF-B、VEGF進(jìn)行檢測(cè)，了解NO濃度對(duì)OA滑膜細(xì)胞白細(xì)胞介素(

4、IL)-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，并推測(cè)它們與NO之間的相關(guān)關(guān)系。 4、所測(cè)數(shù)據(jù)以X±S表示，統(tǒng)計(jì)用SPSS10.0軟件。各組數(shù)據(jù)比較：先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析及多組均數(shù)間的LSD法檢驗(yàn)；否則，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的非參數(shù)：Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P=0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相關(guān)分析，采用Pearson相關(guān)分析，P=0.05為有統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)差異。 結(jié)果 1、組織塊原代培養(yǎng)3天后，可見細(xì)胞從滑膜組織塊邊緣逸出。2～3周形成密集的單層細(xì)胞鋪滿瓶壁，部分區(qū)域呈堆積樣或漩渦狀生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過兩～三次傳代后，大部分為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)免疫組化鑒定可達(dá)95％以上。在未加入LPS組，培養(yǎng)上清中iNOS的含量極低，與培養(yǎng)基對(duì)照組比較無明顯差異(P=0.295)。加入LPS后，iNOS的含量隨加入的LPS的濃度的增加而逐漸增加(P<0.05)?；ぜ?xì)胞在LPS誘導(dǎo)下，

6、加入不同濃度的AG，隨加入的AG濃度的增加，NO表達(dá)的量逐漸減少(P<0.05)。 2、滑膜細(xì)胞+AG組NO濃度與滑膜細(xì)胞空白組比較無顯著性差異(P=0.089)?；ぜ?xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組與滑膜細(xì)胞+LPS組、滑膜細(xì)胞+LPS+AG組比較有顯著性差異(P<0.001)。滑膜細(xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組與滑膜細(xì)胞+LPS組MMP-1濃度比較有顯著性差異(P<0.05)。余各組MMP-1濃度兩兩較無顯著性差異(P>0.05)

7、。MMP-1濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=0.782，P<0.001，存在正相相關(guān)關(guān)系?；ぜ?xì)胞+AG組MMP-3濃度與滑膜細(xì)胞空白組比較無顯著性差異(P>0.05)。滑膜細(xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組與滑膜細(xì)胞+LPS組、滑膜細(xì)胞+LPS+AG組比較有顯著性差異(P<0.05)。MMP-3濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=0.868，P<0.001，存在正相相關(guān)關(guān)系?；ぜ?xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組、滑膜細(xì)胞+LPS組及滑膜細(xì)胞

8、+LPS+AG組MMP-9濃度比較無顯著性差異(F=0.105；P>0.05)。MMP-9濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=0.126，P=0.596，兩者間無相關(guān)關(guān)系。 3、滑膜細(xì)胞+AG組IL-6濃度與滑膜細(xì)胞空白組比較無顯著性差異(P=0.497)。滑膜細(xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組與滑膜細(xì)胞+LPS組、滑膜細(xì)胞+LPS+AG組IL-6濃度比較有顯著性差異(P<0.05)。IL-6濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=0.8

9、79，P<0.001，存在正相相關(guān)關(guān)系?；ぜ?xì)胞+AG組TGF-β濃度與滑膜細(xì)胞+空白組比較無顯著性差異(P=0.211)?；ぜ?xì)胞+AG組、滑膜細(xì)胞空白組與滑膜細(xì)胞+LPS組、滑膜細(xì)胞+LPS+AG組比較有顯著性差異(P<0.05)。TGF-β濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=-0.818，P<0.001，存在負(fù)相相關(guān)關(guān)系。 滑膜細(xì)胞+lAG組、滑膜細(xì)胞+空白組、滑膜細(xì)胞+LPS組及滑膜細(xì)胞+LPS+AG組VEGF濃度比較無

10、顯著性差異(F=0.6845，P=0.575)。VEGF濃度與NO濃度間的相關(guān)關(guān)系分析，r=0.165,P=0.488,無明顯相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論 1、滑膜細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中，在正常情況下僅有少量的NO及iNOS表達(dá)，而加入LPS后，滑膜細(xì)胞NO及iNOS的表達(dá)明顯增加。而再加入AG后，能有效的抑制滑膜表達(dá)NO及iNOS。AG為iNOS特異性抑制劑，不是完全抑制NO生成。 2、滑膜細(xì)胞培養(yǎng)體系中，NO與MMP-1、