補(bǔ)腎活血法治療強(qiáng)直性脊柱炎臨床研究及抗骨化作用實(shí)驗(yàn)探討.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)發(fā)病機(jī)制至今不明，西醫(yī)治療缺乏特異的治療方法，雖有TNF-α阻斷劑、反應(yīng)停、帕米膦酸鹽等新療法的報(bào)道，但并未使AS治療出現(xiàn)根本性改觀。中醫(yī)藥治療AS具有療效好、副作用小的優(yōu)勢(shì)，深入研究中醫(yī)證治規(guī)律非常重要。本課題采用隨機(jī)、對(duì)照、單盲前瞻性研究，評(píng)價(jià)以補(bǔ)腎活血立法組方的補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS臨床療效與安全性，為中醫(yī)補(bǔ)腎活血法治療AS提供有力的臨床證據(jù)；采用中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

2、，借助現(xiàn)代生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、westernblot及免疫組化等前沿技術(shù)，從細(xì)胞分子生物學(xué)角度探討補(bǔ)腎活血法抗AS骨化作用及可能的分子機(jī)制?！　”疚膶?duì)祖國(guó)醫(yī)學(xué)歷代文獻(xiàn)關(guān)于AS的相關(guān)病名、病因病機(jī)及治法方藥進(jìn)行了整理歸納，總結(jié)導(dǎo)師馮興華主任醫(yī)師治療AS的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，提煉為“本在腎虛督空，治以補(bǔ)腎壯督；標(biāo)在濕熱痹阻，治以清熱利濕；痹有血瘀作祟，活血化瘀，貫穿始終”的學(xué)術(shù)思想；從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)遺傳和免疫學(xué)角度，分析了腎藏

3、象在AS發(fā)病中的重要作用，提出“將遺傳信息的獲取、表達(dá)、調(diào)控及AS免疫自穩(wěn)網(wǎng)絡(luò)的重建與中醫(yī)補(bǔ)腎法有機(jī)結(jié)合”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。4.強(qiáng)調(diào)血瘀在強(qiáng)直性脊柱炎病理過(guò)程中的重要作用，提出“外感六淫、腎精虧虛、臟腑內(nèi)傷及久病入絡(luò)均可致瘀，AS瘀在脊柱、腰尻，治須化瘀通督”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。　　對(duì)62例AS腎虛血瘀證患者進(jìn)行了為期6個(gè)月的隨機(jī)、對(duì)照、單盲前瞻性研究，評(píng)價(jià)以補(bǔ)腎活血立法組方的補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS的療效與安全性。采用國(guó)際ASAS工作組確立的AS評(píng)價(jià)

4、因子，療效量化并確定療效判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS的疾病療效作出客觀性評(píng)價(jià)；依照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》AS中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS腎虛血瘀證進(jìn)行證候療效評(píng)價(jià)。　　補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用柳氮磺胺吡啶(SASP)治療AS均取得較好療效，AS疾病療效總有效率分別達(dá)81.82％和86.21％，中醫(yī)腎虛血瘀證候總有效率分別達(dá)96.7％、93.1％?！　⊙a(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒對(duì)AS患者Bath病情活動(dòng)指數(shù)、Bath

5、功能指數(shù)、疼痛、晨僵等臨床癥狀均有明顯的改善作用；并能改善患者Schober試驗(yàn)、胸廓活動(dòng)度、指地距等體征；對(duì)ESR、CRP亦有改善作用?！　⊙a(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS療效具有明顯的時(shí)效性，隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，療效逐漸增強(qiáng)。　　補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS療效并未因聯(lián)合應(yīng)用SASP而顯著提高，只是起效時(shí)間早于單用中藥組；但是，與SASP的聯(lián)用，增加了患者因服用SASP出現(xiàn)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)性，并增加了治療費(fèi)用?！　⊙a(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒治療AS臨床療效滿意，安全

6、性與依從性好，服用方便，具有廣闊的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值?！　”狙芯繉?guó)際ASAS疾病評(píng)價(jià)因子與中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià)有機(jī)結(jié)合，對(duì)中藥治療AS的疾病療效和中醫(yī)證候療效進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，促進(jìn)了中醫(yī)藥治療AS臨床研究的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，為補(bǔ)腎活血法治療AS提供了有力的臨床證據(jù)?！　∫試?guó)家自然科學(xué)基金為依托，將祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論思維與現(xiàn)代生命科學(xué)前沿技術(shù)相結(jié)合，以體外培養(yǎng)AS患者髖關(guān)節(jié)囊成纖維細(xì)胞作為反應(yīng)體系，采用中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，借助現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)

7、實(shí)時(shí)定量PCR、westernblot、免疫組化、熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)等前沿技術(shù)，從AS成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及成骨型分化入手，研究以補(bǔ)腎活血立法組方的補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒及淫羊藿苷單體抗AS骨化作用。1AS成纖維細(xì)胞有限細(xì)胞系建立　　采用組織塊原代培養(yǎng)法，成功建立了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的AS髖關(guān)節(jié)囊成纖維細(xì)胞有限細(xì)胞系，免疫組化染色波形絲蛋白陽(yáng)性，角蛋白陰性，鑒定為中胚層來(lái)源的成纖維細(xì)胞。為研究AS骨化發(fā)病機(jī)制及藥物抗骨化作用相關(guān)提供了較好的體外模

8、型。2AS成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及向成骨型分化的生物學(xué)特性　　以正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細(xì)胞為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)AS成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著快于正常對(duì)照組，接種后第2天即出現(xiàn)生長(zhǎng)速度的差異，在第6天生長(zhǎng)速度較正常成纖維細(xì)胞上升了63.2％；細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，AS成纖維細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，S期(DNA合成期)的細(xì)胞比例較正常成纖維細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)，大量DNA復(fù)制，同時(shí)G0/G1期(DNA合成前期)細(xì)胞比例顯著降低；PI/Hoechst333

9、42雙染熒光鏡觀察，AS成纖維細(xì)胞少見(jiàn)凋亡現(xiàn)象；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，AS成纖維細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均較正常成纖維細(xì)胞顯著減少(P＜0.05)。結(jié)果提示，在AS骨化進(jìn)程中，細(xì)胞異常增殖及凋亡受抑可能是加速AS骨化的重要因素。　　AS成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性、膠原合成及上清液骨鈣素(OC)分泌量均較正常成纖維細(xì)胞明顯增高(P＜0.05，P＜0.01)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)AS成纖維細(xì)胞成骨性標(biāo)志基因cbfa1、OC

10、mRNA表達(dá)均較正常成纖維細(xì)胞顯著增強(qiáng)(P＜0.01，P＜0.001)；Westernblot顯示，AS成纖維細(xì)胞cbfa1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而正常成纖維細(xì)胞此蛋白未見(jiàn)明顯表達(dá)。結(jié)果提示，AS成纖維細(xì)胞已“關(guān)閉”的成骨性標(biāo)志基因的重新開(kāi)啟，引起了成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的異常分化，最終導(dǎo)致了AS局部骨化的形成。3補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)AS成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及向成骨型分化的影響　　補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒含藥血清小、中劑量對(duì)AS成纖維細(xì)胞異常增殖

11、具有抑制作用(P＜0.05)，并調(diào)控細(xì)胞周期，抑制AS細(xì)胞成纖維細(xì)胞進(jìn)入S期，使細(xì)胞停滯于G0/G1期；另外，含藥血清小、中、大劑量有不同程度誘導(dǎo)AS成纖維細(xì)胞凋亡的作用，使細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯增高(P＜0.01，P＜0.001)。SASP含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡無(wú)影響。結(jié)果提示，補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒抑制AS成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、調(diào)控細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可能是其阻斷AS骨化進(jìn)程的重要機(jī)制之一。　　補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒含藥血

12、清大劑量抑制細(xì)胞ALP活性、膠原合成及OC分泌，中劑量抑制ALP活性和OC分泌，但對(duì)膠原合成無(wú)影響；小劑量及SASP含藥血清對(duì)三者均無(wú)作用。含藥血清大劑量尚能抑制細(xì)胞成骨標(biāo)志基因cbfa1mRNA表達(dá)，小、中、大劑量皆抑制cbfa1蛋白表達(dá)；另外，中、大劑量對(duì)cbfa1下游蛋白OCmRNA的表達(dá)也有抑制作用。結(jié)果提示，補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒通過(guò)抑制AS成纖維細(xì)胞成骨表型的表達(dá)，阻斷了AS成纖維細(xì)胞成骨潛能的發(fā)揮及向成骨型的分化；其分子機(jī)制是通過(guò)抑

13、制AS成纖維細(xì)胞成骨性標(biāo)志基因cbfa1、OC的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。4淫羊藿苷單體對(duì)AS成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及向成骨型分化的影響　　補(bǔ)腎強(qiáng)脊顆粒君藥淫羊藿的主要成分淫羊藿苷單體既不能抑制AS成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，又不能阻斷細(xì)胞進(jìn)入DNA合成旺盛的S期，亦無(wú)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。但是，淫羊藿苷可抑制AS成纖維細(xì)胞成骨表型表達(dá)，小劑量抑制膠原合成，中劑量抑制ALP活性和膠原合成，大劑量對(duì)ALP活性、膠原合成及OC分泌均有明顯的抑制作用。另外，淫羊

14、藿苷各劑量對(duì)AS成纖維細(xì)胞cbfa1mRNA和蛋白的表達(dá)均有明顯的抑制作用，并隨藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)；小、大劑量對(duì)AS成纖維細(xì)胞OCmRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用(P＜0.01)。結(jié)果提示，淫羊藿苷抑制AS成纖維細(xì)胞向成骨型分化，其分子機(jī)制是通過(guò)抑制成骨性標(biāo)志基因cbfa1、OC的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。　　實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，補(bǔ)腎活血法治療AS發(fā)揮抗骨化作用的可能機(jī)制是通過(guò)抑制AS成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及阻斷其向成骨型的定向分化，

15、最終阻斷了AS的骨化進(jìn)程。淫羊藿苷單體對(duì)細(xì)胞的整體調(diào)控作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)遜于復(fù)方作用。　　在臨床研究中，將國(guó)際ASAS疾病評(píng)價(jià)因子與中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià)有機(jī)結(jié)合，綜合評(píng)價(jià)中藥治療AS的疾病療效和中醫(yī)證候療效，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)同類報(bào)道。　　在實(shí)驗(yàn)研究中，以攜帶遺傳信息和功能特性的AS患者髖關(guān)節(jié)囊成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)AS成纖維細(xì)胞具有增殖異常活躍、凋亡受抑及向成骨型定向分化的生物學(xué)特性；在此基礎(chǔ)上，從細(xì)胞增殖、分化、凋亡及基因表達(dá)和調(diào)控等多