乙型肝炎病毒Pre-C-BCP突變熱點(diǎn)的焦磷酸測序方法的建立及其可靠性研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起急性肝炎及慢性肝病的主要原因，其長期慢性感染還與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。在全世界，約有3.5億的慢性HBV感染者，而我國就約有1.2億，每年與乙型肝炎相關(guān)的死亡人數(shù)達(dá)30萬例左右，占傳染病死亡第一位。HBV作為嗜肝脫氧核糖核酸病毒科中的一員，其復(fù)制為逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，缺乏校對功能，并在人體免疫、外界藥物等因素的共同影響下，常易發(fā)生變異。其中，Pre-C/BCP的突變最為突出，并在慢性肝病患者中常見。Pr

2、e-C常見突變熱點(diǎn)有G1896A、G1899A，BCP常見突變位點(diǎn)有A1762T、G1764A、C1766T。這些突變不僅可以導(dǎo)致血清中病毒標(biāo)志物的改變，改變機(jī)體對感染細(xì)胞的免疫反應(yīng)，還可改變HBV復(fù)制能力，如增加HBV病毒的毒力，導(dǎo)致較嚴(yán)重的肝病活動，促進(jìn)慢性肝病向肝硬化及肝癌發(fā)展的進(jìn)程，與暴發(fā)性肝炎、重型肝病及肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，如何準(zhǔn)確可靠地診斷相應(yīng)位點(diǎn)的基因突變，是HBv相關(guān)疾病準(zhǔn)確診斷和科學(xué)治療的基礎(chǔ)，亦是預(yù)后最重要的參

3、考依據(jù)，故急需建立其相應(yīng)的準(zhǔn)確可靠的臨床診斷方法。而目前對于HBV Pre-C/BCP基因突變的檢測的常用檢測方法有DNA測序法、PCR-RFLP(PCR及限制性片段長度多態(tài)性分析法)、熒光實(shí)時PCR LightCycler法及基因芯片檢測技術(shù)。這些方法雖都能較好地檢測相應(yīng)的突變，但各有其顯著的不足之處，如PCR-RFLP，PCRLightCycler每次只能檢測一個突變位點(diǎn)，不能同時對多位點(diǎn)突變進(jìn)行檢測；DNA測序法和基因芯片檢測技術(shù)

4、花費(fèi)昂貴、步驟煩瑣，距臨床檢測要求都存在著明顯的距離，不能作為常規(guī)臨床檢測技術(shù)而廣泛應(yīng)用于臨床。故急需尋找新的檢測方法和技術(shù)，以滿足臨床工作的需要。 焦磷酸測序作為一種新型DNA測序技術(shù)，可通過檢測DNA合成過程中所釋放的焦磷酸而獲得待測核苷酸序列，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高自動化、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，費(fèi)用低廉，適合臨床批量檢驗(yàn)的特點(diǎn)，有望適用于HBV Pre-C/BCP多位點(diǎn)基因突變的檢測。但由于該技術(shù)起步較晚，迄今國內(nèi)外尚未見運(yùn)用

5、焦磷酸測序技術(shù)對Pre-C/BCP突變位點(diǎn)的檢測的報道。為此，我們在前期研究YMDD焦磷酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展此研究，以期探索一種新的自動化和高通量檢測HBV Pre-C/BCP熱點(diǎn)突變的方法。研究目的： 在我們前期研究YMDD焦磷酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，以焦磷酸測序技術(shù)為平臺，建立一種檢測Pre-C/BCP突變熱點(diǎn)的檢測方法，并驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、可靠性及進(jìn)行初步臨床檢測，以期建立一種高效、高通量、自動化、低成本的Pre

6、-C/BCP突變位點(diǎn)的臨床檢測方法。 材料與方法： 1、材料 1．1參考標(biāo)準(zhǔn)品(血清)參考標(biāo)準(zhǔn)品1為6份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有Sanger測序法檢測結(jié)果；參考標(biāo)準(zhǔn)品2為12份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有基因芯片檢測法的結(jié)果。 1．2 PCR擴(kuò)增及電泳相關(guān)材料核酸提取液，PCR擴(kuò)增引物，10mm dNTP，10x PC

7、R buffer，瓊脂糖等。 1．3焦磷酸測序相關(guān)材料70﹪乙醇、2×洗滌結(jié)合緩沖液、超級順磁性磁珠、復(fù)性緩沖液、SQA Reagent Kit、PSQ96孔板、PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、PSQ 96 Sample Vacuum PrepWorktable、PSQ96MA測序儀等(Biotage公司)。 1．4臨床待檢血清標(biāo)本60份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10

8、<'4>，HBeAg陰性)。 2、方法及觀察項(xiàng)目2．1焦磷酸測序片斷的PCR擴(kuò)增方法的建立及其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測先進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)擴(kuò)增片段及確定最佳退火溫度后，在此基礎(chǔ)上對參考標(biāo)準(zhǔn)品及臨床待檢血清標(biāo)本的Pre-C/BCP突變區(qū)進(jìn)行批量化的焦磷酸測序片斷的擴(kuò)增。 2．2 Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法的建立對參考標(biāo)準(zhǔn)品1的PCR產(chǎn)物的Pre-C/BCP突變區(qū)進(jìn)行焦磷酸

9、測序。先將參考標(biāo)準(zhǔn)品1的PCR產(chǎn)物磁珠固定，通過PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、Worktable及相關(guān)試劑進(jìn)行堿變性，洗滌，將DNA雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?，再加入測序引物與單鏈退火雜交，最后在PSQ96MA測序儀中進(jìn)行測序。 2.3焦磷酸測序法的精確性、可靠性、重復(fù)性的驗(yàn)證2.3.1參考標(biāo)準(zhǔn)品的焦磷酸測序結(jié)果分別與Sanger測序法、基因芯片檢測法的結(jié)果進(jìn)行對照。 2.3.2參考標(biāo)準(zhǔn)品1的90次重

10、復(fù)焦磷酸測序結(jié)果進(jìn)行對照。 2.4臨床待檢血清標(biāo)本的焦磷酸測序檢測運(yùn)用焦磷酸測序技術(shù)，一次性對60份臨床待檢血清標(biāo)本的PCR產(chǎn)物同時進(jìn)行Pre-C/BCP多個突變位點(diǎn)的檢測。 結(jié)果： 1、焦磷酸測序片斷的擴(kuò)增方法的建立通過梯度PCR實(shí)驗(yàn)及系列實(shí)驗(yàn)，確定了本研究的最適PCR條件為：最佳退火溫度為54℃后，獲得了約260bp的目標(biāo)片斷，并在此基礎(chǔ)上對參考標(biāo)準(zhǔn)品及臨床待檢血清進(jìn)行批量化的焦磷酸測序片斷的擴(kuò)增，結(jié)果顯示1

11、0<'4>滴度水平以上的78例HBV血清標(biāo)本均獲得了有效擴(kuò)增，陽性率達(dá)100﹪。 2、Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法的建立首先應(yīng)用焦磷酸測序?qū)⒖紭?biāo)準(zhǔn)品1的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，成功建立了Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法，其結(jié)果與Sanger。法測序結(jié)果的符合率為100﹪，提示焦磷酸測序技術(shù)是一種高精確性的檢測技術(shù)。 3、參考標(biāo)準(zhǔn)品2的焦磷酸測序檢測結(jié)果及相符性分析參考標(biāo)準(zhǔn)品2的焦磷酸測序結(jié)果與其既往3個月內(nèi)的基

12、因芯片檢測結(jié)果的符合率達(dá)11/12，僅有1例不符合，不排除該例存在繼發(fā)突變可能。由此可見，焦磷酸測序技術(shù)是一種可與基因芯片檢測技術(shù)相媲美的，準(zhǔn)確率高的臨床檢測方法。 4、焦磷酸測序技術(shù)的可靠性、重復(fù)性驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)對參考標(biāo)準(zhǔn)品1進(jìn)行90次重復(fù)焦磷酸測序，其測序結(jié)果符合率為100﹪，表明了焦磷酸測序技術(shù)是一種檢出率高，重復(fù)性好的可靠的檢測技術(shù)。 5、臨床待檢血清標(biāo)本的焦磷酸測序檢測在前述研究的基礎(chǔ)上，我們一次性對60份標(biāo)本的多位點(diǎn)突變

13、進(jìn)行測序檢測，結(jié)果顯示：共檢出60例，26例有位點(diǎn)突變，其中一例還發(fā)現(xiàn)了T1758C突變。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)建立的基于焦磷酸測序技術(shù)的Pre-C/BCP突變檢測技術(shù)，在臨床標(biāo)本檢測中，亦達(dá)到了高通量、多位點(diǎn)及自動化的檢測目的，有望成為一種新的臨床檢測方法。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)針對臨床急需的Pre-C/BCP基因突變的檢測所建立的焦磷酸測序技術(shù)是一種準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)、可一次性檢測HBV Pre-C/BCP多位點(diǎn)突變的高通量的檢