大黃魚免疫球蛋白單抗的制備及在虹彩病毒疫苗效果評價(jià)中的應(yīng)用研究.pdf

1、大黃魚是中國最重要的海水養(yǎng)殖魚類。近年來，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚受到各類寄生蟲、弧菌、假單胞以及病毒病的威脅。2005年以來，研究報(bào)道表明虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬的病毒感染各種包括大黃魚在內(nèi)的各種海水魚類，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別在中國東海養(yǎng)殖區(qū)域較為嚴(yán)重。疫苗將有可能成為一種效果明顯、無環(huán)境危害的虹彩病毒防控措施，但病毒疫苗的研制需建立一種有效的疫苗效果評價(jià)方法。
　　本研究采用硫酸胺沉淀法和親和柱層析法分離提取大黃魚免疫球蛋白，硫酸胺

2、沉淀法采用20-50％飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級沉淀；親和層析采用 GE公司的高效 A蛋白柱和高效 G蛋白柱直接吸附魚血清中的免疫球蛋白，結(jié)果表明A蛋白柱可從大黃魚血清直接提取純化IgM，對IgM有良好的提取回收率和良好的純度，血清不需經(jīng)預(yù)處理；而 G蛋白柱提取的大黃魚 IgM與柱結(jié)合較弱，回收率差。SDS-PAGE電泳表明經(jīng) A蛋白柱提取的IgM顯示兩條帶，與大黃魚的重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）大小相對應(yīng)。
　　用純化的IgM與弗氏佐

3、劑，以0.5mg/只腹腔注射 Balb/c小鼠，首次免疫采用完全佐劑乳化(含卡介苗)，第二次起采用不完全佐劑注射，共進(jìn)行5次注射。收集免疫后小鼠血清，用大黃魚純化抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，測定小鼠血清的ELISA滴度。小鼠血清與大黃魚抗體有良好的抗體效價(jià)，ELISA滴度達(dá)1：16000，與草魚、鯽魚和鳊魚抗體無交叉反應(yīng)，但與黑魚、鱖魚和加州鱸等鱸形目魚類存在一定的交叉反應(yīng)。取經(jīng)大黃魚純化抗體免疫后的小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0

4、融合，用加 HAT選擇的1640培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，再用提純大黃魚IgM包被ELISA板，采用間接ELISA法篩選抗大黃魚IgM特異性抗體，單抗顯示較好的特異性，與鱸形目其他魚類無交叉反應(yīng)。
　　收集虹彩病毒 PCR陽性的患病大黃魚，取病毒組織，經(jīng)均勻后，離心取上清液，用10%PEG+0.5M NaCl沉淀病毒，提粗純化病毒，用此病毒包被 ELISA板，建立了測定病毒的間接ELISA法。用該法檢測虹彩病毒陽性的患病大黃魚血清和無