PPARδ受體激動(dòng)劑在孢和脂肪酸和TNF-α誘導(dǎo)的小鼠近曲小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、前言
　　 隨著現(xiàn)代飲食習(xí)慣和生活方式的改變,在世界范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率逐年增加。在西方國家,糖尿病腎病是引起終末期腎病(ESRD)最常見的病因,在發(fā)展中國家,其發(fā)病率也逐年增加。蛋白尿和腎小球硬化是糖尿病腎病最主要的特征。近年來應(yīng)用ARB類藥物的強(qiáng)化治療通過減少蛋白尿的排出,能改善糖尿病腎病患者的預(yù)后,但是在一些情況下,ARB也不能起作用。近年來人們越來越意識(shí)到脂毒性在糖尿病腎病進(jìn)展過程中的作用,游離脂肪酸結(jié)合的白蛋白被腎小球

2、濾過膜濾過,從近曲小管重吸收,能引起嚴(yán)重的小管間質(zhì)損傷。腎小管間質(zhì)損傷與慢性腎臟病預(yù)后的關(guān)系更加密切,因此有必要研發(fā)新的治療策略,防止和延緩小管間質(zhì)損傷的進(jìn)展,改善糖尿病腎病的預(yù)后。
　　 過氧化物增殖體激活受體(Peroxisome proliferator activated receptors(PPARs))屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族的一員。目前發(fā)現(xiàn)該家族有3種異構(gòu)體:PPARα,δ和γ。作為轉(zhuǎn)錄因子的PPARs通

3、過調(diào)節(jié)特定的目的基因的表達(dá),影響脂代謝,糖代謝穩(wěn)態(tài),細(xì)胞分化,免疫反應(yīng),炎癥和腫瘤等重要的代謝過程。PPARs能被大量的內(nèi)源性和越來越多的外源合成的配體所激活。PPARα受體激動(dòng)劑(貝特類)和PPARγ受體激動(dòng)劑(噻唑烷二酮類)作為降脂藥物和胰島素增敏劑已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用,而且被證明具有腎臟保護(hù)作用;而PPARδ受體激動(dòng)劑出現(xiàn)的較晚,還處于臨床試驗(yàn)階段,其是否具有腎臟保護(hù)作用還沒有定論。目前一些研究表明PPARδ受體參與炎癥的過程,在

4、心臟,脂肪組織,內(nèi)皮細(xì)胞,巨噬細(xì)胞等組織和細(xì)胞中PPARδ受體激動(dòng)劑有抗炎作用,但是PPARδ受體在腎臟組織和細(xì)胞的作用還鮮有報(bào)道。
　　 目的:
　　 基于這些發(fā)現(xiàn),我們假設(shè)PPARδ受體激動(dòng)劑在近曲小管上皮細(xì)胞能發(fā)揮抗炎作用,是一種潛在的治療糖尿病腎病的新選擇。為了證明這一假設(shè),我們利用GW501516這一高選擇性的PPARδ受體激動(dòng)劑進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):利用游離脂肪酸結(jié)合的白蛋白誘導(dǎo)的蛋白負(fù)荷性腎病小鼠模型這一小管間質(zhì)損

5、傷的模型,給予PPARδ受體激動(dòng)劑GW501516,觀察PPARδ受體激動(dòng)劑是否能發(fā)揮抗炎作用,減輕小管間質(zhì)的損害;利用培養(yǎng)的小鼠近曲小管上皮細(xì)胞,觀察GW501516是否能減輕飽和脂肪酸,TNF-α和白蛋白誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并探討其分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 建立脂肪酸結(jié)合白蛋白誘導(dǎo)的蛋白負(fù)荷性腎病小鼠模型。預(yù)先用含有PPARδ受體激動(dòng)劑501516的治療食物和對照食物喂養(yǎng)小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腎臟行HE染色,F4/80免疫

6、組化染色,觀察治療組和對照組腎小管間質(zhì)損傷以及腎間質(zhì)中巨噬細(xì)胞浸潤的變化。并用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測腎組織中巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),F4/80 mRNA水平的變化,
　　 培養(yǎng)小鼠近曲小管上皮細(xì)胞系,研究PPARδ受體激動(dòng)劑GW501516是否能抑制白蛋白,飽和脂肪酸和TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1mRNA水平的變化。利用干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的PPARδ基因敲除研究GW501516

7、的抗炎作用是否通過PPARδ受體實(shí)現(xiàn),并研究核因子-Kappa b(NF-Kb)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在GW501516抗炎過程中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1)與對照組相比,脂肪酸結(jié)合的牛血清白蛋白腹腔注射4天組小鼠體重減輕(20.52±1.53g vs26.26±2.62 g,p＜0.05)腎重/體重的比率增加(0.84±0.1％vs0.64±0.03 p＜0.05)。與GW501516對照組相比,蛋白負(fù)荷+GW5015

8、16治療組體重也減輕(20.2±1.53 g vs24.25±1.11g p＜0.05),腎重/體重的比率增加(0.86±0.14％VS0.56±0.02％,p＜0.05)。但蛋白負(fù)荷組與蛋白負(fù)荷+GW501516治療組之間無明顯差異(20.52±1.53 VS20.2±1.53,p＞0.05)。而各組血清胱抑素水平在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后無明顯變化(678.64±27.95 ng/ml VS579.68±51.55 ng/ml VS618±8

9、4.27 ng/mlVS573.12±60.75 ng/ml),各組間的差異不顯著(p＞0.05)。
　　 (2)HE染色顯示:腹腔注射游離脂肪酸結(jié)合的白蛋白能引起嚴(yán)重的近曲小管損傷,病理改變特征為彌漫性的近曲小管上皮細(xì)胞空泡變性,腎小管細(xì)胞萎縮和管腔擴(kuò)張,管型形成。預(yù)先喂食含有GW501516食物的小鼠其小管損傷明顯減輕。而對照組和單純GWS01516治療組的近曲小管上皮細(xì)胞無明顯的變化。模型組的腎小管損傷評分明顯增加,而GW

10、501516治療組的腎小管損傷評分明顯改善(2.925±0.993 vs1.467±0.776),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。F4/80免疫組化染色顯示模型組在腎小管周圍腎間質(zhì)區(qū)F4/80陽性的巨噬細(xì)胞明顯增加,而GW501516治療能明顯地減輕巨噬細(xì)胞的浸潤。
　　 (3)與對照組相比,蛋白負(fù)荷組腎臟MCP-1,TNF-α和F4/80mRNA的表達(dá)水平明顯增加,GW501516治療使三者的表達(dá)明顯降低,且與模型組比較有顯著差

11、異(p＜0.05)。
　　 (4)150uM的棕櫚酸,10nMTNF-α和30％白蛋白刺激12小時(shí)能誘導(dǎo)小鼠近曲小管上皮細(xì)胞MCP-1在mRNA水平上的表達(dá)增加,而GW501516以劑量依賴(1um,2.5um,5um)的方式抑制棕櫚酸和TNF-α和誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)的增加。在5 um濃度下,這種抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。但是GW501516在任何濃度下均不能抑制白蛋白誘導(dǎo)的MCP-1水平的增加。
　　 (

12、5)PPARδsiRNA能在蛋白水平和基因水平阻斷PPARδ受體的表達(dá),而且在阻斷細(xì)胞中GW501516誘導(dǎo)PPARδ受體靶基因丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4),脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(ADRP)的表達(dá)相應(yīng)被阻斷。但是在阻斷細(xì)胞中GW501516仍然能夠發(fā)揮抗炎作用,抑制棕櫚酸和TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1在mRNA水平的表達(dá)。
　　 (6)培養(yǎng)的近曲小管上皮細(xì)胞在棕櫚酸刺激后1小時(shí),抑制激酶B(IkB)的磷酸化增加,p65的核轉(zhuǎn)移也

13、增加。其上游的調(diào)節(jié)因子絲裂原活化蛋白激酶MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)及轉(zhuǎn)化生長因子β-激活激酶1(TAK1)的磷酸化在棕櫚酸刺激1小時(shí)后也增加。而GW501516預(yù)處理能抑制TAK1,IkB的磷酸化和p65的核轉(zhuǎn)移。而對MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)的磷酸化不發(fā)生影響。
　　 (7)在TNF-α刺激的近曲小管上皮細(xì)胞,我們也得到類似的結(jié)果。培養(yǎng)的近曲小管上皮細(xì)胞在TNF-α刺激后5分鐘后,IkB的磷酸化

14、增加,10分鐘后p65的核轉(zhuǎn)移也增加。其上游的調(diào)節(jié)因子TAK1的磷酸化在TNF-α刺激5分鐘后也增加。而GW501516預(yù)處理抑制IkB的磷酸化和p65的核轉(zhuǎn)移,以及TAK1的磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在游離脂肪酸結(jié)合的白蛋白負(fù)荷性腎病小鼠模型中,脂蛋白重吸收導(dǎo)致近曲小管損傷和巨噬細(xì)胞在間質(zhì)的浸潤,并引起炎癥性細(xì)胞因子MCP-1,TNF-αmRNA水平的升高。PPARδ受體激動(dòng)劑GW501516能減輕游離脂肪酸

15、結(jié)合的白蛋白負(fù)荷性腎病大鼠腎小管間質(zhì)的損傷和炎癥反應(yīng),具有腎臟腎臟保護(hù)作用。
　　 (2)在培養(yǎng)的小鼠近曲小管上皮細(xì)胞中,PPARδ受體激動(dòng)劑GW501516能抑制棕櫚酸和TNF-α誘導(dǎo)MCP-1mRNA水平的增加,但是GW501516不能抑制白蛋白誘導(dǎo)的小鼠近曲小管上皮細(xì)胞MCP-1mRNA水平的增加。GW501516在近曲小管上皮細(xì)胞能發(fā)揮抗炎作用。
　　 (3)PPARδ受體激動(dòng)劑GW501516的抗炎活性可能與P