中醫(yī)五臟相關(guān)理論探討及補脾益腎法對大鼠MSCs增殖和分化的影響.pdf

1、研究目的： 對五臟相關(guān)理論進行梳理和探討，在此基礎(chǔ)上，對子系統(tǒng)“脾腎相關(guān)”理論進行更為深入的研究，提出“骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)為脾腎相關(guān)細胞層次表達的存在形式”的工作假說，探討補脾益腎法對大鼠MSCs增殖和分化的影響，從微觀角度和干細胞水平研究脾腎相關(guān)。 研究方法： 一、五臟相關(guān)理論探討 (一)五臟相關(guān)學(xué)說的緣起： 1.五臟相關(guān)源流探討：經(jīng)考證，詞義最接近、年代最早的文獻是《素問.玉機真臟論

2、》：“五臟相通，移皆有次”。古人通過闡述五臟功能互用和臟腑相合相通理論、氣機升降出入、疾病的傳變、五臟旁通之說、天人相應(yīng)及藥性歸經(jīng)理論體現(xiàn)五臟之氣相通。 2.中醫(yī)五臟相關(guān)學(xué)說的形成與發(fā)展：鄧鐵濤教授在幾十年的臨床實踐中，把五行學(xué)說和臟腑學(xué)說結(jié)合起來，提出了“五臟相關(guān)”學(xué)說。 (1)理論研究繼續(xù)深化：90年代末本世紀初，鄧鐵濤教授指導(dǎo)兩位博士研究生趙氏、鄭氏對五臟相關(guān)學(xué)說科學(xué)內(nèi)涵進行探討。認為五臟相關(guān)學(xué)說是對中醫(yī)經(jīng)典理論五

3、行學(xué)說的繼承和發(fā)展，具有跨學(xué)科的特點。. (2)五臟相關(guān)學(xué)說臨床研究：五臟相關(guān)臨床研究是目前研究的重點，主要有兩個層次的研究，一是五臟相關(guān)總體層面的研究，二是深入到子系統(tǒng)如兩臟相關(guān)的研究。面上的研究顯示五臟相關(guān)理論已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各個系統(tǒng)疾病的治療，與此同時，各個子系統(tǒng)的研究也逐漸開展。目前，以兩兩相關(guān)的研究較多。如脾(胃)腎相關(guān)，心脾(胃)相關(guān)，肝脾(胃)相關(guān)，膽胃相關(guān)，肺脾(胃)相關(guān)，心肺相關(guān)，心膽相關(guān)，心腎相關(guān)，肺腎相關(guān)

4、，肝腎相關(guān)，肝肺相關(guān)等。 (3)五臟相關(guān)學(xué)說實驗研究：部分學(xué)者進行了實驗研究，揭示了五臟中的肝、脾(這里指空腸絨毛)、腎之間的相生、相克關(guān)系，“肺腎相關(guān)”的物質(zhì)基礎(chǔ)，中醫(yī)“心腎相關(guān)”理論的科學(xué)內(nèi)涵等。 (二)脾腎相關(guān)子系統(tǒng)研究： 中醫(yī)脾腎相關(guān)子系統(tǒng)以闡發(fā)脾和腎相關(guān)的生理功能、病理變化機理及其證治方藥為中心內(nèi)容，體現(xiàn)了臟腑同病病機和整體觀念。與傳統(tǒng)的中醫(yī)理論比較，脾腎相關(guān)吸取了五行學(xué)說中“土制水”的精神內(nèi)核，并綜合

5、了歷代醫(yī)家對脾腎相互關(guān)系的不斷發(fā)展，而將二者之間動態(tài)的、錯綜復(fù)雜的相互關(guān)系用“相關(guān)”來概括。近年來，國內(nèi)有關(guān)脾腎相關(guān)的實驗研究報道陸續(xù)出現(xiàn)，多從神經(jīng)遞質(zhì)、激素、內(nèi)分泌、細胞因子水平進行研究。 二、補脾益腎法對大鼠MSCs增殖和分化的影響： 1.MSCs的分離和培養(yǎng) 取4周齡SPF級SD大鼠4只，無菌條件下取雙股骨及脛骨，收集骨髓腔內(nèi)組織細胞，密度梯度離心，收取單核細胞層，加入IMDM培養(yǎng)液。計數(shù)板計數(shù)，按1×10

6、4個/瓶密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后半量更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞。以后每3d換液一次，觀察細胞形態(tài)、貼壁及生長情況。細胞培養(yǎng)7-10天后細胞密度較高，達90％融合后，胰蛋白酶消化，常規(guī)傳代。 2.雙標免疫組化檢測： 傳三代后的細胞種入在裝有IMDM空白培養(yǎng)基的24孔板中，24小時后固定；經(jīng)3％H2O2消化內(nèi)源性酶，正常山羊血清封閉，一抗用多克隆兔抗(CD44、CD5

7、4)，二抗用生物素化羊抗兔，BCTP/NBT顯色。雙標阻斷液阻斷后，正常山羊血清封閉，一抗用Brdu(小鼠單克隆抗體)，二抗用生物素化羊抗小鼠IgG，加SABC，最后用DAB顯色。 3.MTT法細胞活性檢測： 制備單細胞懸液，計數(shù)，接種于96孔板，1×103個細胞/孔，分別加入相應(yīng)劑量的血清或藥物。各組同時培養(yǎng)達72h后每孔加入MTT，繼續(xù)孵育4h，每孔吸去50μl培養(yǎng)液。然后每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，用

8、酶標儀測光吸收值(OD)，繪制增殖曲線。所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，用t檢驗和單因素方差分析確定差異顯著性。并繪制均數(shù)圖。 4.誘導(dǎo)分化： MSCs傳至第3代時，按1.0×103個細胞/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；接種24小時后，去除非貼壁細胞，分別改用誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3d、7d、14d，空白血清對照在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中改含藥血清為空白血清100μ()

9、，空白對照僅加入IMDM空白培養(yǎng)基1ml。 5.免疫細胞組化分析 誘導(dǎo)分化3、7、14天后終止培養(yǎng)，多聚甲醛固定，過氧化氫封閉，滴加羊血清，加入一抗工作液(myosin、desmin)，生物素標記羊抗小鼠IgG，DBA顯色，或加用蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗，試驗對照用未誘導(dǎo)的細胞爬片進行染色。觀察誘導(dǎo)后細胞肌分化相關(guān)蛋白(myosin、desmin)表達的觀察，并與陰性對照組及試驗對照組進行比較。

10、 研究結(jié)果： 一、五臟相關(guān)理論研究： 五臟相關(guān)的研究已經(jīng)從文獻、臨床和實驗等多個方向全面鋪開，理論初具框架，內(nèi)容也很豐富，已經(jīng)從面上的研究深入到各個子系統(tǒng)。脾腎相關(guān)作為研究基礎(chǔ)較好，研究模式較完備的子系統(tǒng)之一，在指導(dǎo)痿證(包括運動神經(jīng)元疾病、重癥肌無力，肌營養(yǎng)不良等肌肉疾病及骨質(zhì)疏松癥)治療中取得了突出療效，課題組已經(jīng)進行了大量的文獻整理、理論探討及臨床研究工作，近年來，國內(nèi)有關(guān)脾腎相關(guān)的實驗研究報道陸續(xù)出現(xiàn)，多

11、從神經(jīng)遞質(zhì)、激素、內(nèi)分泌、細胞因子水平進行研究，目前，尚未有從干細胞水平進行脾腎相關(guān)的實驗研究。 二、補脾益腎法對大鼠MSC增殖和分化的影響： 1.MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定： 原代培養(yǎng)，細胞呈圓形，24小時后，部分細胞貼壁，貼壁細胞中有部分細胞體積增大，變形。培養(yǎng)2天后可見瓶內(nèi)散在分布有單個或多個梭形細胞，原代培養(yǎng)至4-6天，細胞緩慢形成由幾個或10-20個細胞組成的細胞克隆，7-9天左右細胞不斷增殖，局部區(qū)域

12、逐步連接成片，當細胞能達到80％以上融合成片，即可進行消化和傳代。免疫細胞雙標化學(xué)染色結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細胞同時表達Brdu和CD44、CD45，表達率達96％以上，表明所培養(yǎng)的是具有分裂和增殖能力的MSCs。 2.各用藥組對MSCs的增殖作用： 強肌健力口服液低、中、高劑量三組在達一定濃度時(5％-10％)均可以促使MSCs增殖，與濃度呈正比，呈明顯量效依賴關(guān)系，表明低劑量組(生理劑量)的強肌健力口服液含藥血清即可以對

13、MSCs的增殖產(chǎn)生明顯的作用。龜板含藥血清低劑量組對MSCs的體外增殖作用與濃度呈正比，呈明顯量效依賴關(guān)系。除龜高10μ(l)加強高10μ(l)、龜高15μ(l)加強高5μ(l)兩個劑量組外，其余強肌健力口服液與龜板混合血清用藥組各組均對MSCs有顯著的增殖作用，除龜高10μ(l)加強低10μ(l)劑量組外，其他與強肌健力口服液含藥血清低、中、高劑量20μ(l)、龜板低劑量含藥血清20μ(l)比較，均有顯著性差異，表明二者合用對MSCs

14、具有更好的增殖作用。 3.各用藥組對MSCs分化的影響： 誘導(dǎo)3天后，強肌健力口服液低劑量組、強肌健力口服液與龜板混合組部分細胞出現(xiàn)陽性反應(yīng)，且其陽性率與劑量無明顯的相關(guān)性，未經(jīng)誘導(dǎo)分化的及空白血清誘導(dǎo)的骨髓間質(zhì)干細胞的胞漿不染色，提示誘導(dǎo)分化后的細胞有肌細胞特性。強肌健力口服液重復(fù)實驗見用藥各劑量組均有部分細胞出現(xiàn)弱陽性反應(yīng)，空白對照為陰性反應(yīng)。誘導(dǎo)后3天，5-氮雜胞苷組部分細胞出現(xiàn)desmin陽性表達，誘導(dǎo)后14d，

15、部分細胞表達myosin，未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞其myosin及desmin表達均呈陰性。陽性細胞主要見于5-Aza10μmol/l濃度組，其中5-Aza15μmol/l組細胞培養(yǎng)三天后大部分死亡。 結(jié)論： 1.鄧鐵濤教授提出的“五臟相關(guān)”學(xué)說，是當代中醫(yī)學(xué)術(shù)發(fā)展的理論組成部分之一，長期以來對中醫(yī)臨床各科有著廣泛的指導(dǎo)作用。中醫(yī)脾腎相關(guān)是“五臟相關(guān)”子系統(tǒng)之一，實驗研究是其薄弱環(huán)節(jié)，未有從干細胞水平進行的研究。 2.實驗

16、所培養(yǎng)的為有增殖能力的MSCs，生理劑量的強肌健力口服液含藥血清即可以對MSCs的增殖產(chǎn)生明顯的作用，且呈明顯量效依賴關(guān)系。.一定比例配比的強肌健力口服液與龜板混合血清對MSCs的增殖作用較單純的強肌健力口服液含藥血清或龜板含藥血清強，強肌健力口服液補脾，龜板補腎，說明脾腎并補較之單純補脾或者補腎更能促進MSCs的生長。 3.強肌健力口服液含藥血清及其與龜板混合血清誘導(dǎo)MSCs分化及5-Aza誘導(dǎo)MSCs分化，經(jīng)desmin、m