阻斷VEGF的作用對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變的影響.pdf

1、隨著糖尿病患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)的與日俱增，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)已經(jīng)成為生后最常見(jiàn)的致盲原因。糖尿病患者發(fā)生盲的危險(xiǎn)性是正常人群的25倍。90％以上的糖尿病患者最終會(huì)發(fā)生視網(wǎng)膜病變，其中，1型糖尿病患者中有60％、2型糖尿病患者中有20％會(huì)發(fā)展為增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(PDR)。 以往的大量研究結(jié)果表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在DR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了主導(dǎo)作用。因此，阻斷VEGF的作用有可能會(huì)阻止DR的發(fā)展。二十碳五烯

2、酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)作為VEGF受體——flk-1的封閉劑，對(duì)于實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)有廣闊的前景。除此之外，理想PDR模型的匱乏也一直是阻礙此類(lèi)研究進(jìn)展的關(guān)鍵。所以，為了解決上述問(wèn)題，我們建立了能夠模擬人類(lèi)PDR的理想動(dòng)物模型，并同時(shí)觀測(cè)了EPA在阻止PDR進(jìn)展方面的治療效果。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了五部分實(shí)驗(yàn)： 第一部分：確定EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有無(wú)抑制效應(yīng)，決定其有無(wú)未來(lái)臨床應(yīng)用價(jià)值；并探討

3、抑制增殖的作用機(jī)制。 第二部分：建立能夠模擬人類(lèi)PDR的理想的動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)FFA、光鏡觀察有無(wú)CD105標(biāo)記陽(yáng)性的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、電鏡觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的損害來(lái)確定模型是否成功。 第三部分：在DR發(fā)展的不同階段對(duì)第二部分造成的動(dòng)物模型玻璃體注射EPA，對(duì)FFA、光鏡觀察有無(wú)CD105標(biāo)記陽(yáng)性的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、電鏡觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的損害進(jìn)行觀察，確定EPA有無(wú)治療作用。 第四部分：從分子水平和

4、蛋白質(zhì)水平了解第二部分所建動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值。 第五部分：從分子水平和蛋白質(zhì)水平了解EPA體內(nèi)應(yīng)用對(duì)第二部分所建動(dòng)物模型DR的發(fā)展有無(wú)治療作用。 第一部分二十碳五烯酸對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的研究 目的: 探討EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)及其機(jī)制。 方法: 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定不同濃度EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HumanU

5、mbilical Vascular Endothelial Cells，HUVEC)吸光度A值的影響。采用重復(fù)測(cè)量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類(lèi)型，觀察EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間吸光度A值和細(xì)胞增殖抑制率的比較，采用單因素和重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞周期、增殖指數(shù)及凋亡的影響，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用R×C列聯(lián)表的x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: MTT比色法顯示EPA濃度≥0.15g/L時(shí)，對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞吸光度A值降低的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，與濃度無(wú)關(guān)；對(duì)其細(xì)胞增殖抑制率的影響亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，用藥組細(xì)胞增殖指數(shù)為23.9％，低于未用藥組(26.9％)，無(wú)凋亡峰出現(xiàn)，表明EPA僅通過(guò)影響細(xì)胞增殖周期的變化抑制細(xì)胞增殖，無(wú)直接促進(jìn)凋亡的作用。 結(jié)論: EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人

7、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制效應(yīng)，該效應(yīng)通過(guò)封閉flk-1受體和影響細(xì)胞增殖周期實(shí)現(xiàn)；EPA對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)直接促進(jìn)凋亡的作用，因此不會(huì)對(duì)體內(nèi)正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損害，具有良好的臨床應(yīng)用前景。 第二部分 PDR動(dòng)物模型的建立--理想PDR動(dòng)物模型的探討 目的: 建立能夠模擬人類(lèi)PDR的理想動(dòng)物模型。 方法: 用健康SD(Sprague-Dawley)大鼠，鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ

8、)誘導(dǎo)制造糖尿病大鼠模型，1月后玻璃體注射VEGF，注射后第2周、4周、8周觀察熒光素眼底血管造影(Fluorescence Fundus Angiography，F(xiàn)FA)改變、光鏡觀察有無(wú)CD105標(biāo)記陽(yáng)性的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、電鏡觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的損害。并與單純STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型作比較。 結(jié)果: 玻璃體注射VEGF后2-4周，F(xiàn)FA發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管熒光素滲漏、視網(wǎng)膜出血、4周發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管等類(lèi)似于臨床上糖尿病

9、患者FFA所見(jiàn)的糖尿病性眼底病變。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)VEGF注射后4周開(kāi)始出現(xiàn)CD105陽(yáng)性的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，與FFA在VEGF注射后4周出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管的結(jié)果相吻合；在VEGF注射后8周還觀察到黃斑區(qū)水腫、滲出等病理改變，與Lebherz的研究結(jié)果一致。電鏡結(jié)果顯示，STZ聯(lián)合VEGF注射組視網(wǎng)膜各層組織超微結(jié)構(gòu)的損害明顯重于單純STZ注射組。 結(jié)論: STZ腹腔注射聯(lián)合VEGF玻璃體注射造成的DR模型不僅可以出現(xiàn)增殖期的病變

10、，還具有周期短、更經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，為臨床上篩選藥物的研究提供了理想動(dòng)物模型。 第三部分 EPA玻璃體注射治療PDR的實(shí)驗(yàn)研究 目的: 明確EPA在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中治療DR是否有效。 方法: 選用健康SD大鼠，STZ誘導(dǎo)制造糖尿病模型，1月后玻璃體注射VEGF。隨機(jī)分為D、E、F組，于注射同時(shí)(背景期)、注射后2周(增殖前期)、4周(增殖期)分別玻璃體注射EPA，應(yīng)用FFA、CD105免疫組化光鏡觀察陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞和電鏡觀

11、察視網(wǎng)膜各層超微結(jié)構(gòu)的變化。并與第二部分中建立的PDR動(dòng)物模型進(jìn)行比較。 結(jié)果: FFA結(jié)果顯示，增殖前期給藥后2周內(nèi)效果最佳，而背景期給藥后8周內(nèi)均有效，隨時(shí)間延長(zhǎng)藥效不斷增強(qiáng)；增殖前期給藥后6周時(shí)效果差于背景期給藥后2、4、8周時(shí)；與未用藥組相比，在相同的病程時(shí)均未觀察到視網(wǎng)膜新生血管。增殖期給藥后，仍可觀察到視網(wǎng)膜新生血管形成，并且DR也沒(méi)有明顯減輕。CD105免疫組化結(jié)果顯示，相同的病程內(nèi)，背景期和增殖前期給藥組未觀察到

12、CD105陽(yáng)性的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞。但增殖期給藥組仍觀察到CD105陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞。電鏡結(jié)果表明，在增殖前期給藥后6周和增殖期給藥后4周視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損害有所減輕。 結(jié)論: EPA可以在DR背景期和增殖前期封閉flk-1，阻斷DR的發(fā)展；還對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。 第四部分不同DR大鼠模型VEGF、flk-1、bax、bcl-2在視網(wǎng)膜組織中表達(dá)的變化 目的: 觀察我們

13、建立的PDR大鼠模型視網(wǎng)膜組織中VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表達(dá)變化，確定其成功性和優(yōu)勢(shì)。 方法: 采用析因設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)用免疫組化方法對(duì)第二部分中建立的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表達(dá)進(jìn)行觀察，應(yīng)用MIAS1998型圖象分析系統(tǒng)測(cè)定VEGF、flk-1、bax、bcl-2在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)網(wǎng)層的平均光密度值。 結(jié)果: 聯(lián)合注藥法所造PDR模型隨病程進(jìn)展，VEG

14、F及其特異性受體flk-1在視網(wǎng)膜的表達(dá)漸增強(qiáng)，與以往研究及我們的前期研究結(jié)果吻合。由于受到藥物吸收過(guò)程的影響，其在不同層次視網(wǎng)膜組織的表達(dá)略受影響，但8周時(shí)趨于平穩(wěn)，比相同病程的單純注藥法表達(dá)增強(qiáng)；聯(lián)合注藥法所造PDR模型隨病程進(jìn)展，bax在視網(wǎng)膜的表達(dá)漸增強(qiáng)，與對(duì)單純注藥法所造模型的研究一致。由于受到藥物吸收過(guò)程的影響，其在不同層次視網(wǎng)膜組織的表達(dá)略受影響，但8周時(shí)趨于平穩(wěn)，比單純注藥法所造模型相同病程時(shí)的表達(dá)增強(qiáng)。隨DR病程進(jìn)展，

15、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層bcl-2的表達(dá)增加，可能是機(jī)體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的一種代償性保護(hù)機(jī)制。 結(jié)論: 聯(lián)合注藥法所造PDR模型從分子水平和蛋白質(zhì)水平能較好地模擬人類(lèi)PDR，優(yōu)于單純注藥法。 第五部分 EPA治療后對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、flk-1、bax、bcl-2表達(dá)的影響 目的: 明確EPA治療后對(duì)VEGF、flk-1、bax、bcl-2在DR大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)的影響，以期闡明EPA對(duì)DR治療作用的機(jī)

16、制。 方法: 采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的的實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)用免疫組化方法對(duì)第二部分中建立的糖尿病大鼠模型和第三部分中EPA注射治療后的大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表達(dá)進(jìn)行觀察，應(yīng)用MIAS1998型圖象分析系統(tǒng)測(cè)定VEGF、flk-1、bax、bcl-2在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)網(wǎng)層的平均光密度值。 結(jié)果: 1、EPA在背景期給藥后4周內(nèi)和增殖前期給藥后2周內(nèi)可以使VEGF在視網(wǎng)膜內(nèi)層的表達(dá)減弱，對(duì)PDR

17、的發(fā)生有阻止的作用，而在增殖期給藥后4周反而增強(qiáng)，說(shuō)明EPA增殖期給藥對(duì)抑制VEGF表達(dá)無(wú)效。 2、EPA在背景期、增殖前期給藥治療后2周可有效地抑制flk-1的表達(dá)，從而抑制了VEGF與有效的flk-1受體結(jié)合并發(fā)揮作用。 3、玻璃體注射EPA后8周內(nèi)，可以通過(guò)減弱bax在視網(wǎng)膜的表達(dá)抑制DR的進(jìn)展，背景期和增殖前期治療效果優(yōu)于增殖期，但具體機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。 4、玻璃體注射EPA后6周內(nèi)，由于抑制了DR進(jìn)

18、展，使得bcl-2在視網(wǎng)膜的代償性高表達(dá)減弱，但在8周時(shí)，這種減弱消失，bcl-2繼續(xù)發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，對(duì)阻止DR時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的損害有益。 結(jié)論: EPA在背景期和增殖前期體內(nèi)應(yīng)用可通過(guò)封閉flk-1受體，抑制VEGF發(fā)揮作用延緩DR的進(jìn)展；還可以下調(diào)凋亡促進(jìn)基因bax的表達(dá)抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡減輕DR的進(jìn)展；早期可抑制機(jī)體的保護(hù)性。bcl-2高表達(dá)，但在8周時(shí)消失，使得bax/bcl-2比值降低，對(duì)周細(xì)胞的缺失有保護(hù)作