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文檔簡介
1、背景:
目前,世界上超過1.5億人為2型糖尿病患者,到2020年人數(shù)將會增加2倍。2型糖尿病患者大多體型肥胖,且常伴有高脂血癥,如果治療不當會導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥,如腎衰、失明、視神經(jīng)炎、傷口愈合慢、動脈病(包括冠狀動脈疾?。┑?。目前國內(nèi)外許多學(xué)者認為2型糖尿病可能是由炎癥細胞因子介導(dǎo)的一種免疫性疾病,此觀點被稱為2型糖尿病的“炎癥學(xué)說”,2型糖尿病的炎癥機制自此成為糖尿病學(xué)者研究的熱點。
研究者發(fā)現(xiàn),炎癥因子的過度分泌
2、及炎癥通路的持續(xù)激活導(dǎo)致的慢性炎癥狀態(tài),可能誘發(fā)胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生。細胞核因子KappaB(NF-κB)是廣泛分布于細胞的核轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。IκBα是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑,由于IκBα的存在,NF-κB在細胞質(zhì)中處于靜止狀態(tài);許多細胞外免疫刺激物誘導(dǎo)IκKβ活化,作用于IκBα使其磷酸化,誘導(dǎo)NF-κB與IκBα解離,NF-κB被活化,進入細胞核,調(diào)控相關(guān)炎性因子的表達,過度表達的促炎因子是導(dǎo)致胰島素
3、抵抗的一個重要因素。研究桑葉提取物對高胰島素誘導(dǎo)的HepG2細胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠中NF-κB信號通路的影響,在2型糖尿病的治療過程中具有重要臨床意義。
目前,用于治療2型糖尿病藥物分為胰島素和口服降糖藥,口服降糖藥主要分為如胰島素促泌劑、胰島素增敏劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑以及雙胍類等傳統(tǒng)降糖藥;隨著藥物的發(fā)展一些新型降糖藥也已逐漸進入臨床使用,如:GLP-1激動劑---艾賽那肽和利拉普泰,DPP-4抑制劑---西
4、格列汀和維格列汀,SGLT-2抑制劑和GPR119激動劑等,但這些新藥僅僅通過幾千例患者,可能會掩蓋很多情況,對于其實際療效、安全性及副作用還有待于臨床積累資料,因此目前臨床還是主要采用傳統(tǒng)降糖藥,但西藥治療雖然能從表面快速降低血糖,但不能從根本上降低糖尿病的發(fā)生,而且還存在許多副作用,因此尋找降糖中藥成了新的治療策略。中藥作為中國特色的傳統(tǒng)醫(yī)藥,在治療2型糖尿病及其并發(fā)癥方面進行了大量的實踐,同時積累了大量的臨床經(jīng)驗,已被廣泛用于2型
5、糖尿病的治療,是進一步研究和開發(fā)降糖新藥的寶貴資源。桑葉為??浦参锷5母稍锶~,屬甘寒之品,具有降血壓、血脂、抗炎等作用,在民間曾廣泛用于治療消渴病,本課題組也一直致力于桑葉降糖的研究,從原材料的選取,桑葉有效提取物的提取分離及純化,到降糖機制,進行了一系列的研究。
根據(jù)文獻分析及課題組前期研究基礎(chǔ),本文章分別以HepG2細胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠為研究對象,觀察桑葉生物堿(Mulberry leaves Alkaloi
6、ds,MLE)、桑葉多糖(Mulberry leaves polysaccharides,MLP)、桑葉黃酮(Mulberryleaves flavonoids,MLF)對高胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠NF-κB信號通路相關(guān)基因、蛋白及炎癥因子表達的影響,探討桑葉提取物對2型糖尿病可能產(chǎn)生的保護作用,以便為其臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。具體如下:
第一部分桑葉提取物對IR-HepG2細胞NF-κB信號
7、通路相關(guān)基因表達的影響
目的:建立HepG2細胞的胰島素抵抗模型,探討桑葉有效部位對模型細胞IκBα、IκKβ基因mRNA表達及NF-κB活化的影響。
方法:以人肝癌HepG2細胞為研究對象,10μg·mL-1胰島素培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h,建立胰島素抵抗的HepG2細胞(IR-HepG2)模型;將IR-HepG2模型細胞隨機分為模型組,總多糖組,總黃酮組,總生物堿組,羅格列酮組,分別體外培養(yǎng)胰島素抵抗的HepG2細
8、胞,另以HepG2細胞作為正常對照組,cck8法檢測胰島素抵抗的HepG2細胞的增值,葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)檢測細胞上清液中葡萄糖含量,確定各實驗組的最佳干預(yù)濃度。RT-qPCR法檢測IKKβ、IκBαmRNA的表達,Western Blot法檢測IκBα蛋白表達反映NF-kB的活性。
結(jié)果:高胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生胰島素抵抗后,IKKβ表達量明顯增加,NF-κB活性增加;應(yīng)用桑葉提取物干預(yù)后,桑黃酮、多糖、生
9、物堿可以降低IKKβmRNA、IκBα mRNA的表達;且桑黃酮、生物堿可以抑制IκBα降解,抑制NF-κB的活性。
結(jié)論:高胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生胰島素抵抗后,NF-κB信號通路在一定程度上被激活,表明胰島素抵抗與NF-κB炎癥通路間存在一定的關(guān)系;桑葉提取物能夠抑制NF-κB的活化,從而為桑葉用于臨床防治2型糖尿病提供了一定的理論依據(jù)。
第二部分桑葉提取物對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠糖代謝的影響
10、 目的:觀察桑葉各提取物(多糖,黃酮,生物堿)對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠糖代謝的影響。
方法:預(yù)實驗確定各藥物組給藥劑量。根據(jù)體重、血糖將KKAy小鼠隨機分為5組,分別設(shè)模型組(IR),桑多糖(MLP,1000 mg·kg-1)、桑黃酮(MLF,1000mg·kg-1)、桑生物堿(MLA,30 mg·kg-1)和羅格列酮(RSG,2 mg·kg-1),每組各6只,另以10只C57BL/6小鼠為正常對照組(NC)。實驗中,K
11、KAy小鼠喂飼專屬飼料,C57BL/6小鼠喂飼普通飼料,各給藥組灌胃給藥,模型組與正常組以純水灌胃,1次/d,共4周,每周記錄1次體質(zhì)量,每周每組隨機取2-3只小鼠測定空腹血糖。末次給藥后1h,水合氯醛腹腔麻醉,打開腹腔,迅速剝離肝臟、附睪脂肪,稱重,計算肝臟和附睪脂肪系數(shù),置于液氮中保存用于檢測各實驗組肝糖原含量。
結(jié)果:桑葉各提取物(多糖,黃酮,生物堿)均能夠降低KKAy小鼠體重,肝臟指數(shù)以及附睪脂肪系數(shù),降低附睪脂肪重量
12、,不同程度改善KKAy小鼠的空腹血糖水平,明顯增加肝糖原含量,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
結(jié)論:桑葉各提取物(多糖,黃酮,生物堿)可減輕自發(fā)型2型糖尿病KKAy小鼠體重,降低空腹血糖,增加肝糖原含量,有利于血糖的長期穩(wěn)定控制,同時抑制小鼠由于高糖狀態(tài)而引起的肝臟,脂肪組織腫大。
第三部分桑葉提取物對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠血清因子的影響
目的:觀察桑葉提取物(多糖,黃酮,生物堿)自發(fā)性2
13、型糖尿病KKAy小鼠血清炎癥因子IL-6、CRP以及TNF-α的影響。
方法:隨機將KKAy小鼠分為5組,分別設(shè)模型組(IR),桑多糖(MLP,1000mg/kg)、桑黃酮(MLF,1000mg/kg)、桑生物堿(MLA,30mg/kg)和羅格列酮(RSG,2mg/kg),每組各6只,另以10只C57BL/6小鼠為正常對照組(NC)。實驗干預(yù)如上。末次給藥后1h,水合氯醛腹腔麻醉,斷頭取血,3000r/min,離心15min,
14、取血清,-70℃保存。按照ELISA試劑盒進行檢測。
結(jié)果:與正常對照C57BL/6小鼠相比,模型組KKAy小鼠血清IL-6、CRP、以及TNF-α含量明顯增加(P<0.01);桑葉干預(yù)4周后,與模型組比較,各給藥組KKAy小鼠血清IL-6、CRP、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。
結(jié)論:桑葉通過調(diào)節(jié)血清IL-6、CRP以及TNF-α的水平,減輕KKAy小鼠的胰島素抵抗,從而恢復(fù)正常代謝。
第四部分
15、桑葉提取物對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及附睪脂肪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達的影響
目的:探討桑葉提取物(多糖,黃酮,生物堿)對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及附睪脂肪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達的影響。
方法:從液氮中拿出肝臟及附睪脂肪組織,放入研缽中,液氮研磨成粉末,加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑的混合物繼續(xù)研磨至勻漿,RIPA裂解取上清,即蛋白液。BCA法檢測蛋白濃度,Western Bl
16、ot法檢測兩種組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達。
結(jié)果:與正常對照組(NC)相比,模型組KKAy小鼠肝臟及附睪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達升高(P<0.01);藥物干預(yù)后,與模型組相比,各實驗組肝臟及附睪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達降低(P<0.05),IκBα降解明顯被抑制。
結(jié)論:自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及脂肪組織中NF-κB炎癥信號通路被激活,IκKβ及IκBα蛋白的磷酸化水平升高,
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