阿爾茨海默病過程中單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞遷移入腦機(jī)制的探討.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，它的發(fā)病率約占65-69歲人群的0.6％，70-74歲人群的1.0％，在85歲以上人群中的比例占到了8.4％，從而成為日益突出的公共健康問題。AD的主要病理特征包括進(jìn)行性記憶減退、認(rèn)知功能障礙、以及人格改變，影響病人的日常生活。這些癥狀的出現(xiàn)是神經(jīng)元死亡的結(jié)果，尤其是邊緣系統(tǒng)和皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)，這些與記憶相關(guān)的部位。
　　AD病因

2、是復(fù)雜且多種多樣的，發(fā)病機(jī)制也有很多種解釋，目前研究的熱點(diǎn)主要集中在AD腦內(nèi)存在的免疫炎癥反應(yīng)，以及其應(yīng)用于臨床治療的前景;炎性介質(zhì)，氧化應(yīng)激反應(yīng)，后天獲得性免疫之間的相互作用。在AD腦內(nèi)的病理損傷部位存在著與外周免疫反應(yīng)相同特征的炎性反應(yīng)。在外周免疫系統(tǒng)，退化的組織和大量不可溶的非正常物質(zhì)的沉積都是免疫反應(yīng)發(fā)生的誘因。同樣的，在AD腦內(nèi)，受損的神經(jīng)元，不可溶性Aβ(amyloidbeta)的沉積和神經(jīng)纏結(jié)等也都可以成為炎癥反應(yīng)發(fā)生的誘

3、因。
　　目前有許多證據(jù)表明AD伴隨著全身性免疫反應(yīng)，血液中免疫細(xì)胞的分布及反應(yīng)性都會發(fā)生變化。神經(jīng)炎性反應(yīng)會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，比如Aβ或者炎性介質(zhì)透過血腦屏障進(jìn)入外周血。這將導(dǎo)致全身性免疫反應(yīng)，骨髓源細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)積聚。因此，AD病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)間的交通將影響免疫細(xì)胞在外周血和腦內(nèi)的分布以及免疫介質(zhì)的產(chǎn)生。
　　血液來源的免疫細(xì)胞在AD發(fā)病方面的作用過去常常被忽視，但如今已經(jīng)非常受到

4、重視。有研究證明APP23轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中有免疫細(xì)胞浸潤，其中27％-31％為T細(xì)胞，7％是單核細(xì)胞，更有研究表明在AD腦內(nèi)，許多細(xì)胞因子和炎性趨化因子水平明顯高于正常老年人群。這些證據(jù)強(qiáng)烈的提示免疫系統(tǒng)在AD病變的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　AD腦內(nèi)存在的單核吞噬細(xì)胞可以被Aβ以及促炎性因子，炎性趨化因子直接活化，也可以與進(jìn)入腦內(nèi)的T淋巴細(xì)胞發(fā)生“cross-talk”而活化，活化的單核吞噬細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子影

5、響神經(jīng)元功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)。因此，針對外周血免疫細(xì)胞跨血腦屏障遷移入腦機(jī)制的研究有重大科學(xué)意義。
　　方法:
　　1、AD病人外周血單核細(xì)胞高表達(dá)CSF2RB對其跨血腦屏障遷移的影響
　　(1)AD病人外周血單核細(xì)胞的分離:選取沈陽地區(qū)AD病30例，同年齡健康對照26例，用肝素抗凝處理過的試管，于清晨空腹采肘靜脈血，室溫放置，采血后3小時(shí)內(nèi)用分離人外周血單核細(xì)胞的Dynabeads(@)CD14磁珠試劑盒分離人

6、外周血單核細(xì)胞，用Trazol裂解后提取總RNA并委托公司進(jìn)行基因芯片檢測。
　　(2)根據(jù)芯片檢測結(jié)果，篩選有表達(dá)差異的基因，并選取其中的CSF2RB基因進(jìn)行研究。
　　(3)采用定量PCR方法驗(yàn)證AD病人外周血單核細(xì)胞中CSF2RB基因表達(dá)的變化。
　　(4)利用本課題組制作的AD大鼠模型，術(shù)后3天和7天分別采集外周血并分離單核細(xì)胞，定量PCR方法驗(yàn)證CSF2RB基因的表達(dá)是否與對照組存在差異。
　　(5)利

7、用慢病毒載體，構(gòu)建特異性CSF2RB基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，建立CSF2RB基因沉默的單克隆細(xì)胞系。
　　(6)利用CSF2RB基因沉默的THP-1細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，分析CSF2RB對單核細(xì)胞遷移能力的影響。
　　2、探討AD病人腦內(nèi)高水平GM-CSF增加血腦屏障通透性的機(jī)制
　　(1)將培養(yǎng)的HBMECs在生長狀態(tài)良好時(shí)，接種到Transwell建立體

8、外血腦屏障模型，觀察經(jīng)過GM-CSF處理HBMECs后跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(TransEndothelial Electrical Resistance, TEER)的變化。
　　(2)采用HRP flux分析GM-CSF處理HBMECs后，體外血腦屏障模型通透性的改變。
　　(3)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測GM-CSF對于HBMECs生長是否有影響。
　　(4) GM-CSF處理HBMECs后，分別使用Real-time PCR、

9、Western blot檢測粘附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-3、claudin-5的表達(dá)水平。
　　(5)擴(kuò)增ZO-1啟動子區(qū)域(-2787～+1)，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測GM-CSF對ZO-1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
　　(6)Western Blot檢測occludin在NP-40可溶型和不可溶型間的轉(zhuǎn)化。
　　(7)免疫共沉淀檢測claudin-5泛素化

10、修飾水平。
　　3、探討AD疾病外周血T淋巴細(xì)胞入腦的機(jī)制
　　(1)構(gòu)建Aβ1-42腦內(nèi)沉積動物模型，免疫熒光檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞MHC-I表達(dá)情況。
　　(2)使用Aβ、BV2培養(yǎng)上清液、Aβ刺激的BV2培養(yǎng)上清液作用HBMECs后，分別使用Real-time PCR、Westem blot檢測MHC-I表達(dá)水平。
　　(3)構(gòu)建含有BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的體外血腦屏障模型，模擬AD腦微環(huán)境對T淋巴細(xì)胞系進(jìn)行遷移分

11、析和粘附分析，并使用MHC-I中和抗體進(jìn)行抗體封閉實(shí)驗(yàn)。
　　(4)使用siRNA干擾HBMECs MHC-I表達(dá)，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞遷移分析及粘附分析。
　　(5)使用TNF-α中和抗體處理經(jīng)Aβ刺激的BV2上清，作用HBMECs后，分別使用Real-time PCR、Western blot檢測MHC-I表達(dá)水平。
　　(6)在Aβ反應(yīng)性的BV2介導(dǎo)的粘附和遷移實(shí)驗(yàn)中，使用TNF-α中和抗體進(jìn)行封閉實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)

12、果：
　　1、AD病人外周血單核細(xì)胞高表達(dá)CSF2RB有助于其跨血腦屏障遷移
　　(1)與同齡對照者相比，AD病人CSF2RB基因表達(dá)上調(diào)。
　　(2)AD大鼠模型外周血單核細(xì)胞中CSF2RB表達(dá)上調(diào)。
　　(3)慢病毒介導(dǎo)的特異性CSF2RB基因沉默THP-1單克隆細(xì)胞株跨血腦屏障遷移的能力下降。
　　2、AD病人腦內(nèi)高水平GM-CSF改變緊密連接蛋白表達(dá)和分布，增加血腦屏障通透性
　　(1)GM-

13、CSF處理HBMECs后跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值降低。
　　(2)GM-CSF處理HBMECs后HRP通過率增高。
　　(3)GM-CSF抑制ZO-1啟動子活性，下調(diào)ZO-1蛋白表達(dá)。
　　(4)GM-CSF增加claudin-5泛素化修飾，促進(jìn)其降解。
　　(5)GM-CSF促進(jìn)occludin由NP-40不可溶型向可溶型轉(zhuǎn)化。
　　3、Aβ誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)MHC-I，促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞遷移入腦

14、>　　(1)AD大鼠模型腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)MHC-I。
　　(2)Aβ刺激的BV2培養(yǎng)上清可上調(diào)HBMECs MHC-I表達(dá)水平。
　　(3)使用MHC-I中和抗體及siRNA干擾HBMECs MHC-I，能夠抑制T淋巴細(xì)胞MHC-I依賴性的遷移及粘附。
　　(4)Aβ可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α表達(dá)，并引起HBMECs MHC-I表達(dá)增加。
　　(5)TNF-α中和抗體能夠抑制Aβ反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴