金欣口服液及白藜蘆醇對(duì)RSV活化誘導(dǎo)的TLR3及其信號(hào)通路的調(diào)控作用.pdf

1、小兒肺炎是兒科最常見疾病之一，嚴(yán)重危害著兒童的健康，目前世界衛(wèi)生組織(WHO)將本病列為全球重要的三種兒科疾病之一，我國(guó)衛(wèi)生部也將其列為重點(diǎn)防治的兒科四大疾病之一。其中病毒性肺炎占小兒肺炎的一半左右，而呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialviral，RSV)又是病毒性肺炎中最常見的病原體，可以引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎等疾病。
　　 RSV感染的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，且缺乏安全有效的疫

2、苗及治療手段，而中醫(yī)藥在治療病毒感染性疾病方面有著獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。金欣口服液是臨床治療小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的常用有效制劑，具有開肺化痰解毒的功效，且前期大量實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)其具有一定的抗RSV活性及免疫調(diào)節(jié)作用。白藜蘆醇是金欣口服液組成藥物虎杖的主要有效成分之一，大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)其具有一定的抗炎抗病毒活性。
　　 Toll樣受體（toll-likereceptors，TLRs）屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，是重要的模式識(shí)別受體(patte

3、rnrecognitionreceptors，PRRs)之一，可以識(shí)別不同微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmoleculepatten,PAMP)。RSV是單股負(fù)鏈RNA病毒，在復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中會(huì)合成大量雙鏈RNA(dsRNA)，故能被識(shí)別dsRNA的TLR3所特異性識(shí)別，通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起下游細(xì)胞因子的大量分泌，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。鑒于中醫(yī)藥作用的多靶點(diǎn)性，本實(shí)驗(yàn)從Toll樣受體3及其介導(dǎo)的信號(hào)

4、通路入手，探討了金欣口服液及其有效組分白藜蘆醇的抗RSV感染機(jī)理。
　　 目的：
　　 研究金欣口服液及白藜蘆醇對(duì)RSV活化誘導(dǎo)的TLR3及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用，探討其治療RSV肺炎的可能免疫學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 體外實(shí)驗(yàn)：RSV感染體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，采用金欣口服液含藥血清及白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，24h后收集細(xì)胞，RealtimeRT-PCR法測(cè)定TLR3及其信號(hào)通路關(guān)鍵分子TRIF

5、、TRAF6mRNA的表達(dá)變化；激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法處理的各組細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)情況；ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠，金欣口服液及白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，并于首次滴鼻后24、72、144h，取各組小鼠肺組織，分別行病理組織切片評(píng)價(jià)肺部病變情況，RealtimeRT-PCR法檢測(cè)肺組織中TLR3、TRIF及TRA

6、F6mRNA表達(dá)情況，蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)各組小鼠肺組織TLR3蛋白表達(dá)情況；取各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，ELISA法檢測(cè)IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 體外實(shí)驗(yàn)：
　　 1．RSV感染RAW264.7細(xì)胞后24h，TLR3mRNA表達(dá)量明顯升高(與正常組比較，P＜0.01)，金欣口服液含藥血清組TLR3mRNA表達(dá)量較RSV感染組顯

7、著降低(P＜0.01)，各濃度白藜蘆醇組TLR3mRNA表達(dá)量較RSV感染組均有不同程度降低（P＜0.01）；RSV感染RAW264.7細(xì)胞后24h，TRIF、TRAF6mRNA表達(dá)量較正常組均略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，金欣口服液含藥血清及各濃度白藜蘆醇組TRIF、TRAF6mRNA表達(dá)量與RSV感染組比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 2．RSV感染RAW264.7細(xì)胞后24h，TLR3蛋白表達(dá)量較正

8、常組明顯升高（P＜0.01）；金欣口服液含藥血清組TLR3蛋白表達(dá)量較RSV感染組明顯降低(P＜0.01)；各濃度白藜蘆醇組無論是預(yù)防給藥還是治療給藥TLR3蛋白表達(dá)量較RSV組均有不同程度降低(P＜0.01)。
　　 3．RSV感染RAW264.7細(xì)胞后24h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β未檢測(cè)出；IL-6、TNF-α表達(dá)量明顯升高（與正常組比較，P＜0.01），金欣口服液含藥血清組IL-6(P＜0.05)、TNF-α（P＜0.0

9、1）表達(dá)量較RSV感染組顯著降低，各濃度白藜蘆醇組IL-6、TNF-α表達(dá)量較RSV感染組均不同程度降低；IFN-β表達(dá)量有所升高（與正常組比較，P＜0.01），金欣口服液含藥血清及各濃度白藜蘆醇組IFN-β表達(dá)量較RSV組比較均不同程度增高。
　　 體內(nèi)試驗(yàn)：
　　 1．RSV感染BALB/c小鼠后肺部病理改變主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)炎，肺泡壁血管擴(kuò)張充血，水腫增厚，肺泡壁及間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡腔基本清晰，無明顯滲出物；支氣

10、管上皮細(xì)胞無明顯變性、壞死，管腔內(nèi)無明顯炎性滲出物。肺部病變程度在24h最輕，隨著感染時(shí)間的推移，病變程度逐漸加重。金欣口服液及白藜蘆醇組小鼠肺內(nèi)炎癥程度均有不同程度減輕，病理評(píng)分結(jié)果顯示治療組各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　 2．RSV感染BALB/c小鼠后24h，肺組織中TLR3mRNA表達(dá)量顯著增高（與正常組比較，P＜0.01），隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR3mRNA的表達(dá)量逐漸下降。RSV感染后24h，金欣

11、口服液和白藜蘆醇組TLR3mRNA表達(dá)量較RSV感染組不同程度降低（P＜0.01），但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，金欣口服液等效劑量組TLR3mRNA表達(dá)量較RSV感染組有所增高，而金欣高劑量組和白藜蘆醇組TLR3mRNA表達(dá)量較RSV感染組無差異(P＞0.05)。
　　 3．RSV感染BALB/c小鼠后24、72、144h，肺組織中TRIF、TRAF6mRNA表達(dá)量與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，金欣口服液和白藜蘆醇組小

12、鼠肺組織TRIF、TRAF6mRNA表達(dá)量與RSV感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4．RSV感染BALB/c小鼠后24h，肺組織內(nèi)TLR3蛋白表達(dá)量較正常組高(P＜0.01)，72h表達(dá)達(dá)到高峰，后逐漸下降。金欣口服液及白藜蘆醇組TLR3表達(dá)量于24h和72h均較RSV感染組不同程度降低（P＜0.01），感染144h時(shí)金欣口服液等效劑量及白藜蘆醇組TLR3表達(dá)量較RSV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

13、r>　　 5．RSV感染BALB/c小鼠后24h，BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量均明顯升高（與正常組比較，P＜0.01），隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量均逐漸下降；RSV感染后24h，金欣口服液和白藜蘆醇組小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量均較感染組顯著下降，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，金欣等效劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)較感染組有所上升，而金欣高劑量組和

14、白藜蘆醇組無上升趨勢(shì)。RSV感染BALB/c小鼠后24h，BALF中IFN-β表達(dá)量與正常組比較無顯著性差異(P＞0.05)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，RSV組IFN-β表達(dá)量逐漸上升。RSV感染后24h，金欣口服液組和白藜蘆醇組IFN-β表達(dá)量較RSV組顯著上升(P＜0.01)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)各給藥組IFN-β表達(dá)量與RSV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1．金欣口服液及白藜蘆醇能夠顯著改善RS

15、V感染小鼠的肺部病變；
　　 2．金欣口服液及白藜蘆醇能夠從核酸和蛋白層面顯著抑制RSV感染早期過度活化的TLR3表達(dá)；
　　 3．金欣口服液及白藜蘆醇對(duì)TLR3信號(hào)通路關(guān)鍵分子TRIF、TRAF6mRNA表達(dá)無明顯的直接調(diào)控作用；
　　 4．金欣口服液及白藜蘆醇能夠顯著調(diào)控RSV感染初期TLR3介導(dǎo)的信號(hào)通路下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的過量表達(dá)；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)上述炎癥因子表達(dá)下降