補(bǔ)腎中藥單體巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷對(duì)AD模型的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性病變，其病理學(xué)特征為淀粉樣蛋白(Amyliod-protein, Aβ)沉積形成老年斑(senile plaques，SPs)、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NETs)以及特有的中樞膽堿能神經(jīng)元的大量死亡及丟失等[1-2]。大腦內(nèi)的Aβ的產(chǎn)生和降解機(jī)制失衡是現(xiàn)在比較公認(rèn)的阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制。<

2、br>　　中藥復(fù)方的研究雖然有多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)，但不能清楚說(shuō)明參與疾病機(jī)制調(diào)控的作用靶點(diǎn)，而中藥單體研究的優(yōu)勢(shì)則更加突顯。
　　中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿爾茨海默病最主要的發(fā)病機(jī)制與腎虛有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取臨床常用的補(bǔ)腎要藥的有效單體成分——巴戟甲素（巴戟天提取物），女貞苷（女貞子提取物），淫羊藿苷（淫羊藿提取物）進(jìn)行篩選，并探討對(duì)AD模型的有保護(hù)作用的補(bǔ)腎單體的可能作用機(jī)制。
　　方法
　　1.篩選淀粉樣蛋白Aβ42對(duì)入神經(jīng)母細(xì)

3、胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞最佳的損傷濃度，然后建立穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型。
　　2.分別在小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和SH-SY5Y細(xì)胞上篩選出補(bǔ)腎中藥單體巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的作用濃度，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，從以上三種中藥單體中篩選出對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性有保護(hù)作用的單體。
　　4.選擇有效的補(bǔ)腎中藥單體，對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　

4、4.1、巴戟甲素對(duì)AD模型保護(hù)作用的機(jī)制探討
　　4.1.1、巴戟甲素對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討:巴戟甲素作用于細(xì)胞12h，免疫印跡法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞低密度脂蛋白受體1(LRP1)，淀粉樣前體蛋白(APP)的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞LRP1mRNA表達(dá)的變化。巴戟甲素分別作用于正常的SH-SY5Y細(xì)胞和SiLRP1SH-SY5Y細(xì)胞后，加入Aβ42，用Elisa法分別檢測(cè)胞內(nèi)胞外的Aβ4

5、2變化水平，激光共聚焦觀察隨時(shí)間變化Aβ42進(jìn)入細(xì)胞及與溶酶體共定位的情況。
　　4.1.2、巴戟甲素對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的影響:選擇7月齡的SPF級(jí)雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠58只(品系名稱:B6C3-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J(簡(jiǎn)稱:APPSWe/PS1dE9)，相同背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6J。雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、巴戟甲素低劑量(20mg/kg)

6、組、巴戟甲素高劑量（80mg/kg）組，每組10只;同背景非轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠作為野生對(duì)照組，每組10只;灌胃處理1個(gè)月。給藥結(jié)束后取小鼠海馬組織，用Western blot檢測(cè)其LRP1的表達(dá)。
　　4.2、女貞苷對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討:女貞苷作用SH-SY5Y細(xì)胞后加入Aβ42，用Elisa法檢測(cè)胞外的Aβ42含量，免疫印跡法檢測(cè)NF-KB，Bcl-2，LC3蛋白變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、:
　　1.使用不同濃度的Aβ42（5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1）損傷SH-SY5Y細(xì)胞，各組細(xì)胞活力均降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但5μmol·L-1、10μmol·L-1損傷SH-SY5Y細(xì)胞的作用不夠強(qiáng)，15μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1均可以損傷的條件下，則選擇最小劑量的15μmol·L-1 Aβ42作為最

8、佳濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　2.在入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y上篩選巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的用藥濃度，結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷濃度達(dá)到500μmol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P＞0.05)。將巴戟甲素、女貞苷再次作用于更為敏感小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷濃度小于500μmol·L-1時(shí)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力亦無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　3.淫羊藿苷濃度為5、50、5

9、00μmol·L-1時(shí)，對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)該AD模型沒(méi)有明顯的保護(hù)作用，后續(xù)的機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)不予選取。
　　4.巴戟甲素對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探討
　　4.1、巴戟甲素的濃度為50、100、500μmol·L-1時(shí)，對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用(P＜0.05)。
　　4.2、巴

10、戟甲素保護(hù)作用初步的機(jī)制探討
　　4.2.1、巴戟甲素作用于SH-SY5Y細(xì)胞12h后，與正常組比較，巴戟甲素組(50、100μmol·L-1)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP1的蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，淀粉前體樣蛋白(APP)表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。Elisa檢測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基中Aβ42的含量，結(jié)果顯示巴戟甲素可以有效增加SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)Aβ42的清除作用，與模型組條件培養(yǎng)基Aβ42含量比較，巴戟甲素(50、10

11、0μmol·L-1)組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量相對(duì)減少(P＜0.05);與模型組胞內(nèi)Aβ42含量比較，巴戟甲素組(50μmol·L-1)胞內(nèi)的Aβ42含量相對(duì)增加(P＜0.05)，巴戟甲素組（100μmol·L-1）胞內(nèi)的Aβ42含量差異不明顯(P＞0.05)。激光共聚焦的結(jié)果顯示根據(jù)時(shí)間點(diǎn)的不同，在30min時(shí)與對(duì)照組相比，巴戟甲素組中的Aβ42進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞的較多。隨時(shí)間增加，在60min時(shí)，巴戟甲素組內(nèi)吞Aβ42多于模型組

12、，但此時(shí)Aβ42與溶酶體的無(wú)共定位。在120min時(shí)，對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)少量的Aβ42與溶酶體的共定位;與之相比，巴戟甲素組的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的Aβ42與溶酶體的共定位要更多。
　　4.2.2、基因干擾LRP1進(jìn)行反向論證:巴戟甲素同時(shí)作用在正常的SH-SY5Y細(xì)胞和SiLRP1的SH-SY5Y細(xì)胞上，Elisa檢測(cè)模型組、巴戟甲素組胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基Aβ42的含量。結(jié)果顯示與模型組條件培養(yǎng)基比較，巴戟甲素組的條件培養(yǎng)基Aβ42的含量無(wú)明顯差

13、異(P＞0.05);與正常SH-SY5Y細(xì)胞模型組Aβ42的含量相比，SiLRP1的SH-SY5Y細(xì)胞胞外Aβ42含量明顯增高(P＜0.05);與正常SH-SY5Y細(xì)胞巴戟甲素組比較，Si LRP1細(xì)胞的巴戟甲素組胞外Aβ42的含量也明顯增加(P＜0.05)?；虺聊M中的巴戟甲素的兩個(gè)用藥組和模型組相比，雖有降低的趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.2.3、轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃1月，取其海馬區(qū)的組織用Western

14、blot法檢測(cè)其LRP1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)巴戟甲素組的LRP1表達(dá)與正常組和模型組的蛋白表達(dá)并未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。
　　5.女貞苷對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探討
　　5.1、女貞苷的濃度為50、100μmol·L-1時(shí)，對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的均有保護(hù)作用，可明顯增加細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。顯微鏡下觀察Aβ42模型組與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，正常對(duì)照組細(xì)胞生

15、長(zhǎng)良好，樹(shù)枝狀軸突明顯，細(xì)胞透亮;模型組細(xì)胞形態(tài)邊緣模糊，細(xì)胞皺縮，軸突消失;與模型組比較，女貞苷兩個(gè)用藥組細(xì)胞凋亡明顯減少。
　　5.2、初步機(jī)制探討:女貞苷作用SH-SY5Y細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3，結(jié)果表明模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對(duì)表達(dá)量與正常組相比明顯增加（P＜0.05），與模型組相較，女貞苷組(50、100μmol·L-1）的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯減少(P＜0.05);NF-κB蛋白

16、表達(dá)與模型組比較，檢測(cè)女貞苷組（50、100μmol·L-1）的明顯減少(P＜0.05)，抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)則明顯增加(P＜0.05)。女貞苷同時(shí)也能增加SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)Aβ42的清除，Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量比較，女貞苷組（50、100μmol·L-1）的Aβ42含量均下降。
　　結(jié)論:
　　1.淫羊藿苷對(duì)Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性損傷沒(méi)有明顯保護(hù)作用。
　

17、　2.巴戟甲素可以保護(hù)Aα42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性損傷，其可能機(jī)制是巴戟甲素作用于SH-SY5Y細(xì)胞可有效增加入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP1的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)Aβ42的轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)吞以及溶酶體對(duì)其清除，減少Aβ42在胞外的沉積從而降低Aβ42產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的海馬區(qū)卻未見(jiàn)LRP1蛋白表達(dá)明顯增加可能由于選擇的動(dòng)物模型與細(xì)胞模型作用機(jī)制不一致引起的。
　　3.女貞苷可