利用Pgl3-Control Vector及酸化玻璃珠分離純化轉(zhuǎn)錄因子的研究.pdf

1、目的：建立一種新的采用酸化玻璃珠法分離純化質(zhì)粒DNA-蛋白復(fù)合物的方法，從pGL3-Control vector瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞中分離SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，進而通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍和快速銀染色，初步分離純化SV40啟動子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為進行肽質(zhì)譜法分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴在宿主菌中轉(zhuǎn)化和大量擴增pGL3-Control vector，制備足夠的高純度pGL3-Control v

2、ector。⑵以pGL3-Control vector瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，優(yōu)化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后在細胞內(nèi)高度表達的時間。⑶甲醛交聯(lián)質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體，以甘氨酸終止交聯(lián)。⑷凍融法制備細胞裂解物，采用酸化玻璃珠法從細胞裂解物中分離純化出質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體。⑸質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體解交聯(lián)獲得結(jié)合蛋白(即為SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄因子)。⑹丙酮沉淀蛋白，行蛋白SDS-PAGE，通過考馬斯亮藍染色和快速銀染色觀察結(jié)合蛋白在膠中的分

3、離情況。⑺后期將會進行蛋白復(fù)合物的2-D PAGE及肽質(zhì)譜法分析鑒定SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄因子種類。
　　 結(jié)果：①pGL3-Control vector在293T細胞中可以高度表達熒光素酶蛋白，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后不同時間點上檢測各組細胞的熒光素酶蛋白表達量，確定了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后高度表達的時間優(yōu)化結(jié)果為40h左右。②通過反復(fù)凍融法可以獲得大量的細胞裂解物，并采用酚氯仿法從細胞裂解物中成功地抽提到pGL3-Control vector，質(zhì)粒P

4、CR擴增后鑒定效果好。③通過甲醛交聯(lián)pGL3-Control vector DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體和酸化玻璃珠纏繞法成功地從細胞裂解物中分離純化出質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體。④pGL3-Control vector DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體經(jīng)解交聯(lián)和丙酮沉淀后，行蛋白復(fù)合物SDS-PAGE，可以明顯看到不同分子水平的蛋白條帶，且大分子條帶居多。⑤收集6平皿(100mm直徑的細胞培養(yǎng)皿)細胞，反復(fù)凍融法裂解后通過以上方法獲得蛋白復(fù)合物，經(jīng)過