玉米ZmCIPK23的克隆與表達分析.pdf

1、CBL(calcineurin B-like protein)是近些年來發(fā)現(xiàn)的植物所特有的一類鈣調磷酸酶B類蛋白，與其靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)相互作用一起在植物應答逆境脅迫的信號轉導過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本實驗室前期通過同源克隆得到ZmCIPK23序列。發(fā)現(xiàn)其與ZmCBL1,4,5,9具有相互作用。根據(jù)擬南芥中的AtCIPK23的功能，推測其可能與低鉀響應有關。但在低鉀脅迫下Z

2、mCIPK23的表達及其功能并不清楚。因此本研究是以玉米的“鄭單958”為實驗材料，利用生物信息學及半定量RT-PCR的方法，對玉米的ZmCIPK23及4個ZmCBLs基因在低鉀脅迫，外源脫落酸及茉莉酸處理下的表達情況進行分析，并克隆了ZmCIPK23的啟動子，構建了Pro-ZmCIPK23與 PCAMBIA1391的融合表達載體，此外還克隆了 ZmCIPK23基因的全長，構建了 ZmCIPK23與pRI-101的過表達載體，為其功能研

3、究奠定基礎。目前已獲得如下結果：
　?。?）分別對長至五葉期的玉米幼苗進行低鉀脅迫處理，對長至兩葉一心期的玉米幼苗進行外源ABA及JA的處理，設計ZmCIPK23和4個ZmCBLs的特異性引物，采用半定量RT-PCR對低鉀、ABA及JA處理下ZmCIPK23和ZmCBLs的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmCIPK23及4個ZmCBLs基因在葉片和根中的表達模式是不同的。低鉀脅迫下，ZmCIPK23在葉片和根中的表達量都在8天時達到最大值

4、。葉片中，ZmCBL1及ZmCBL9的表達基本上沒有變化，整體而言 ZmCBL4，5的表達量較低。根中ZmCBL1,4,5,9的表達量也是在8天時達到最大值。ABA處理下ZmCIPK23在葉片和根中都是從2h開始表達量顯著地升高，6h時表達量達到最大值。JA處理下ZmCIPK23在葉片中是從3h開始表達量顯著地升高，6h時表達量下降，之后表達量又升高。在根中，ZmCIPK23的表達量從12h開始顯著地升高，24h時表達量達到最大值。Zm

5、CBL1,4,5,9在ABA及JA的處理下表達量變化沒有低鉀脅迫明顯。結果表明它們均被不同程度的誘導表達且低鉀脅迫下的表達差異最為顯著。
　?。?）為了進一步明確ZmCIPK23的表達情況，設計特異性引物，以玉米的gDNA為模版，PCR擴增得到1228bp長的ZmCIPK235，端上游的啟動子片段。順式作用元件預測分析表明該基因啟動子區(qū)域具有熱響應、光響應、激素相關、細胞周期調控、發(fā)育相關及其它功能未知的調控結構域。進一步構建Pr

6、o-ZmCIPK23與 PCAMBIA1391的融合表達載體，經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切驗證，表明重組的融合載體構建成功。為進一步通過啟動子活性分析ZmCIPK23的表達奠定基礎。
　?。?）設計特異性引物，以玉米的cDNA為模板，PCR擴增得到1350bp的ZmCIPK23全長。利用在線工具（http://www.plantgdb.org/）分析得知ZmCIPK23基因含有9個外顯子和8個內含子；蛋白結構分析，表明ZmCIP