生物人工腎小管體外構(gòu)建的初步研究.pdf

1、研究背景： 生物人工腎小管輔助裝置(bioartificialrenaltubuleassistdevice，RAD)是目前治療終末期腎臟病的有效方法，RAD是腎臟組織工程研究的重點(diǎn)之一，目前國外RAD已經(jīng)完成由美國食品藥品管理局(FAD)批準(zhǔn)的Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，并取得了令人鼓舞的結(jié)果。 盡管RAD研究取得了很大的進(jìn)展，然而，在RAD構(gòu)建的許多關(guān)鍵問題仍未解決。首先，構(gòu)建RAD的支架是腎臟組織工程種子細(xì)胞生長和增殖的載體

2、，因此如何把支架構(gòu)建好，是腎臟組織工程研究工作的關(guān)鍵問題之一。其二，中空纖維聚砜膜與種子細(xì)胞的更好地黏附，以及其后的生長、增殖、分化等是作好腎臟組織工程研究工作的關(guān)鍵問題之二。 構(gòu)建RAD的支架的問題：RAD的支架可以用血液透析器，例如F60等，但是如果采用F60，其內(nèi)的中空纖維的濾過有效面積1.2m2，假如在1.2m2的纖維上置入的種子細(xì)胞并生長，顯然面積過大。在本研究的第一章，針對(duì)RAD的支架問題，我們研制了一種生物反應(yīng)器，

3、以此來克服RAD的支架的缺陷提供了一個(gè)有效的辦法。 中空纖維聚砜膜與種子細(xì)胞的黏附不能滿足需要的問題：目前種子細(xì)胞種植在生物反應(yīng)器的中空纖維聚砜膜上，由于聚砜膜表面的疏水性和粗糙度不佳，致使中空纖維聚砜膜與種子細(xì)胞的黏附不佳，針對(duì)這一缺陷，我們考慮采用如下方法進(jìn)行改進(jìn)：對(duì)材料表面進(jìn)行納米修飾，材料表面特性對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化和凋亡起重要作用。將材料表面進(jìn)行納米修飾是材料改性研究的熱點(diǎn)之一。 方法： 1.研制生

4、物反應(yīng)器，中空纖維管呈同心圓排列，內(nèi)植1000根聚砜膜中空纖維，有效表面積0.1m2，將納米金組裝到中空纖維聚砜膜表面，根據(jù)納米金溶液浸泡纖維的時(shí)間分別為0h、2h、5h、14h，共四組，得到4種中空纖維聚砜膜/納米金仿生支架，觀察各組中空纖維聚砜膜的粗糙度、吸水性以及材料的表征等情況。 2.植入非洲恒河綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞株(CV1細(xì)胞)、鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)等細(xì)胞在制備的4種生物反應(yīng)器內(nèi)的中空纖維聚砜膜/納米金仿生

5、支架的中空纖維外腔面，繼續(xù)培養(yǎng)2周，構(gòu)建生物人工腎小管，通過采用免疫熒光染色、原子力顯微鏡和掃描電鏡等方法觀察中空纖維聚砜膜表面貼壁生長細(xì)胞的黏附、鋪展、增殖、細(xì)胞數(shù)目和形貌等變化，以及檢測RAD對(duì)Na+、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，觀察哇巴因、根皮苷對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的選擇性地抑制作用，并與未植入細(xì)胞的空白生物反應(yīng)器內(nèi)中空纖維做對(duì)照。 3.我們自行改良的掃描電鏡觀察的方法，對(duì)樣品制備中乙醇脫水進(jìn)行了改進(jìn)，用改良的方法，觀察材料表面的成片細(xì)胞的圖形完整

6、性。 結(jié)果： 1.我們研制的生物反應(yīng)器，這種殼體裝1000根中空纖維膜，封裝的殼體里的中空纖維膜通過試壓測試，全通；殼體內(nèi)的中空纖維膜能做成平板狀。 2.我們自行改良的方法，結(jié)果圖片可見，材料表面成片細(xì)胞連接，無斷裂，圖形完整，從而避免了原來常規(guī)方法的圖片失真的缺陷。 3.三組納米化與一組未納米化的材料相比，三組中空纖維聚砜膜/納米金的吸水率與未納米化相比明顯增加(P＜0.01)，三組納米化之間比較，5h

7、組的中空纖維聚砜膜/納米金的吸水率與2h組、14h組相比明顯增加(P＜0.05)。 4.納米化與一組未納米化的材料相比，2h組、5h組中空纖維聚砜膜/納米金的粗糙度與未納米化相比明顯增加(P＜0.05)，三組納米化之間比較，5h組的中空纖維聚砜膜/納米金的粗糙度與2h組、14h組相比明顯增加(P＞0.05)。 5.三組納米化與一組未納米化的材料相比，三組中空纖維聚砜膜/納米金的的細(xì)胞數(shù)目與未納米化相比明顯增加(P＜0.0

8、1)，能顯著提高種子細(xì)胞貼壁及增殖，三組納米化之間比較，5h組的中空纖維聚砜膜/納米金的粗糙度與14h組相比明顯增加(P＜0.05)。 6.培育14天后的RAD組具有對(duì)Na+和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，轉(zhuǎn)運(yùn)率在哇巴因、根皮苷作用后明顯降低；去除藥物抑制因素后，Na+、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率又能恢復(fù)，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.成功地研制生物反應(yīng)器，并用于構(gòu)建RAD的支架。 2.我們研制了一種

9、掃描電鏡的樣本制備的新方法，這種方法適合觀察中空纖維聚砜/納米金表面生長的細(xì)胞，能真實(shí)的觀察到成片生長細(xì)胞的形貌，避免了原來的常規(guī)方法對(duì)樣品的形態(tài)的破壞。 3.我們研制了中空纖維聚砜膜/納米金仿生支架，全部三組納米化與一組未納米化的材料相比能顯著提高種子細(xì)胞貼壁及增殖，其中5小時(shí)組的中空纖維聚砜膜/納米金的生物學(xué)性能最佳，中空纖維聚砜膜/納米金的表面修飾方法對(duì)于中空纖維聚砜膜表面改性有著重要意義。 4.初步成功建立了一種