利尿劑和滲水利濕中藥對正常大鼠尿液水通道蛋白-2排泄的影響及其機制的研究.pdf

1、【目的】 上世紀90年代初發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白家族是近年來的研究熱點，它的發(fā)現(xiàn)成為人們了解水分子在細胞中的轉(zhuǎn)運機制的新里程碑。而水通道蛋白2(AQP2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具病理生理意義的水通道蛋白之一，是維持機體水平衡調(diào)節(jié)的必需物質(zhì)。AQP2主要分布在腎臟集合管主細胞胞漿內(nèi)和管腔側(cè)細胞膜上，在機體內(nèi)主要受抗利尿激素(血管加壓素，AVP)經(jīng)血管加壓素2型受體(V<,2>R)調(diào)節(jié)，對尿液的重吸收起著較大作用。其中部分腎臟AQP2蛋白可脫

2、落于腎小管腔內(nèi)而被尿液沖出，尿液AQP2是反映AVP作用的內(nèi)在生物學指標。在許多伴有水代謝失衡的疾病中，如充血性心力衰竭、肝硬化、腎病綜合癥等，往往存在有AQP2的表達異常，因此尋找一些能干預(yù)AQP2基因表達的藥物具有較為重大的意義。利尿劑在臨床上被廣泛運用，尤其是在充血性心力衰竭的治療中取得顯著的療效，雖然目前的研究中有一些關(guān)于利尿劑對于尿液AQP2的影響，但是對于腎臟AQP2基因及蛋白的改變卻知之較少。本實驗就正常生理情況下，常用利

3、尿劑對大鼠腎臟AQP2基因和尿液中AQP2的改變進行了研究。另外目前西藥對于AQP2的影響研究國內(nèi)外均有報道，而中藥方面的研究較少。而中藥是我國一個寶貴資源，在某些臨床疾病治療中使用中藥可以起到較好的效果。 根據(jù)已有中藥的相關(guān)信息，選取幾味滲水利濕中草藥作用于實驗大鼠，觀察灌藥侯檢測其對腎臟及尿液AQP2的影響，試圖篩選出一至兩種能干預(yù)AQP2表達的中藥或者單體。 【方法】 人工合成AQP2蛋白C末端的CELHS

4、PQSLPRGSKA多肽片段，并與牛血清白蛋白偶聯(lián)作為標準品，將AQP2多肽與鑰孔血藍蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)相連后免疫家兔，獲得兔抗鼠AQP2多克隆抗體。所有大鼠均單獨飼養(yǎng)在代謝籠中，自由進食，收集尿液。實驗一，對正常大鼠分別應(yīng)用呋塞米(20mg/d·kg)和雙氫克尿噻(25mg/d·kg)和安體舒通(20mg/d·kg)，經(jīng)胃灌入，大鼠自由進水，連續(xù)收集尿液，記錄尿量，用間接ELISA檢測尿液

5、AQP2的變化、對用藥后7天的大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)分別用RT-PCR和免疫印跡法(Western blotting)檢測V<,2>R及AQP2 mRNA和AQP2蛋白。實驗二，從常用的滲水利濕藥物中選取常用且利尿效果明顯的中藥做為初篩對象，連續(xù)灌胃7天，大鼠自由進水，連續(xù)收集尿液，記錄尿量，用間接ELISA法檢測尿液AQP2的變化；實驗三，對初篩過程中尿液AQP2有改變意義的茯苓，豬苓兩種藥物延長灌藥時間至15天，對用藥后15天的大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)分

6、別用RT-PCR和免疫印跡法(Western blotting)檢測V<,2>R及AQP2 tuRNA和AQP2蛋白。 [結(jié)果] 一、呋塞米、雙氫克尿噻及安體舒通對正常大鼠血鈉、尿量、尿滲量用藥7天呋塞米組、雙氫克尿噻組和安體舒通組與對照組相比，血鈉無顯著差異。呋塞米組、雙氫克尿噻組和安體舒通組大鼠尿量均顯著增加有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；呋噻米組在用藥后第4天達尿量峰值。用藥后，呋噻米組和雙氫克尿噻組尿滲量改變有顯

7、著性統(tǒng)計學差異(P<0.001)，呋噻米組尿滲量降低，雙氫克尿噻組尿滲量升高，安體舒通組尿滲量無顯著統(tǒng)計學差異。 二、呋塞米、雙氫克尿噻及安體舒通對正常大鼠尿液AQP2濃度和排泄率的影響正常組大鼠用藥前后尿液AQP2濃度無顯著差異，應(yīng)用三種利尿藥后尿液AQP2濃度均有顯著增加(P<0.001)。但三組之間無顯著統(tǒng)計學差異；三組藥物均引起尿液中AQP2的排泄率顯著增加(JP<0.001)，呋噻米強于雙氫克尿噻和安體舒通。

8、三、呋塞米、雙氫克尿噻和安體舒通對正常大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)中AQP2及V<,2>R mRNA和AQP2蛋白的影響用藥后7天，呋塞米組、雙氫克尿噻組、安體舒通組的AQP2/β-actinmRNA光密度值和AQP2蛋白與對照組相比，呋塞米組AQP2 mRNA和蛋白顯著升高(P<0.001)；雙氫克尿噻組AQP2 mRNA和蛋白顯著減少(P<0.001)；安體舒通組AQP2 mRNA和蛋白則無顯著統(tǒng)計學差異。呋塞米組、安體舒通組和雙氫克尿噻組腎內(nèi)髓質(zhì)

9、中V<,2>-R/β-actin mRNA光密度值與對照組比較，呋塞米組V<,2>-R mRNA顯著提高(P<0.001)，雙氫克尿噻組V<,2>-R mRNA顯著減少(P<0.001)，安體舒通組則無顯著改變。 四、幾種中藥用藥7天對正常大鼠尿量和尿液AQP2濃度的影響在選用的八種中藥中，提氣類中藥人參、黨參、當歸尿量和AQP2濃度改變無顯著統(tǒng)計學差異，而澤瀉和葶藶子組雖然尿量有所增加，但無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而用

10、藥前后尿液AQP2濃度無差異。茯苓組和豬苓組尿量的增加具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)，尿液中AQP2濃度降低有顯著統(tǒng)計學差異。 五、豬苓、茯苓用藥15天對正常大鼠血鈉、尿量和尿滲量的影響用藥15天后，豬苓組、茯苓組和對照組相比，血鈉無顯著差異。尿量增加有顯著性差異(P<0.001)，并隨時間延長尿量增加明顯，尿滲量降低有顯著性差異(P<0.001)， 六、豬苓、茯苓用藥15天對正常大鼠尿液AQP2的影響豬苓組和茯苓

11、組在用藥前5天左右尿液AQP2濃度呈顯著下降趨勢，其后AQP2濃度有所回升，至用藥15天與用藥前比較無顯著統(tǒng)計學差異；而豬苓組AQP2排泄率在用藥后第5天減少有統(tǒng)計學意義，其后有所回升，至用藥第9天左右開始有顯著性統(tǒng)計學差異(P=0.037)。茯苓組在用藥后第5天引起AQP2排泄率減少有顯著統(tǒng)計學差異，其后排泄率有所回升，至第9天左右有顯著性統(tǒng)計學差異，豬苓組引起AQP2排泄增加的效果強于茯苓組。 七、豬苓、茯苓對正常大鼠腎內(nèi)髓

12、質(zhì)中AQP2及V<,2>-R mRNA和AQP2蛋白的影響用藥后15天，豬苓組、茯苓組、AQP2/β-actin mRNA和AQP2蛋白光密度值與對照組相比存在顯著統(tǒng)計學差異(F=121.642，P=0.001)，豬苓組和茯苓組AQP2 mRNA均顯著降低(P<0.001)，且豬苓改變比茯苓明顯(P<0.001)，而V<,2>-R/β-actin mRNA與對照組比較均減少有顯著統(tǒng)計學差異，但兩者之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

13、 [結(jié)論] 一、常用利尿劑呋塞米、雙氫克尿噻和安體舒通都能增加正常大鼠尿量，引起尿液中．AQP2排泄的增加，但呋塞米降低尿滲量、增加腎臟AQP2和V<,2>-R的表達，同時增加腎臟AQP2蛋白表達；雙氫克尿噻則升高尿滲量，減少腎臟AQP2和V<,2>-R mRNA的表達；安體舒通引起腎臟AQP2基因表達改變不明顯。 二、選用的八種中藥中，茯苓和豬苓均引起正常大鼠尿量增加和尿滲量的降低，并在用藥早期降低尿液中AQP2排泄