兔類胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的研究.pdf

1、多能性干細(xì)胞對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。兔作為傳統(tǒng)的試驗(yàn)動(dòng)物，被廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和人類疾病研究。兔的多能性干細(xì)胞—胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell, ESC）和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC）研究仍處于初級(jí)階段，分離培養(yǎng)及鑒定方法還需要進(jìn)一步探索。為完善兔多能性干細(xì)胞的研究方法，本試驗(yàn)分離培養(yǎng)了日本大耳白兔的類ESC，進(jìn)行了多能性鑒定，同時(shí)初步探

2、索了將兔胎兒成纖維細(xì)胞（Rabbit embryo fibroblast, REF）誘導(dǎo)為iPSC的方法。研究結(jié)果如下：
　　1、分離得到了兔類ESC：使用FSH和hCG結(jié)合的方法對(duì)60只母兔進(jìn)行超排，交配96 h后沖取胚胎，平均每只母兔可得38枚胚胎，囊胚率為79.96％。選用76%Knockout DMEM+20%KSR+1%谷氨酰胺+1%NEAA+1%β-巰基乙醇+1%青鏈霉素+10 ng/mL bFGF+1000 IU/m

3、L hLIF作為兔類ESC基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加不同濃度的褪黑素（10-6，10-7，10-8，10-9，0 M），探索褪黑素對(duì)兔囊胚、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass, ICM）、ESC生長增殖的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加褪黑素對(duì)兔囊胚的貼壁率沒有顯著影響，5組囊胚貼壁率均在50%左右，但對(duì)ICM和類ESC的增殖、傳代有促進(jìn)作用，其中褪黑素濃度為10-7 M時(shí)作用最為顯著。10-7 M的褪黑素可以顯著提高ICM的增殖率

4、（P<0.05），由19.97%提升到34.57%。對(duì)ICM進(jìn)行機(jī)械傳代，可以得到形態(tài)扁平，有清晰邊緣的兔類ESC克隆。添加10-7 M褪黑素可以將兔類ESC的傳代數(shù)由4代提高到6代，并且能夠顯著提高第4和第6代的傳代率（P<0.05）。
　　2、對(duì)P5代兔類ESC進(jìn)行鑒定，試驗(yàn)結(jié)果表明，兔類ESC具有多能性：兔類ESC克隆堿性磷酸酶染色為陽性；RT-PCR可以檢測到多能性基因Oct4，Sox2，Klf4, c-Myc, Nano

5、g, Line28a的表達(dá)；qPCR檢測結(jié)果表明，多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表達(dá)量明顯高于兔胎兒成纖維細(xì)胞；免疫熒光染色結(jié)果表明，多能性標(biāo)志蛋白OCT4，SOX2，NANOG為陽性，胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白SSEA-1，SSEA-4和TRA-1-60，TRA-1-81為陽性，其中SSEA-4和TRA-1-60微弱表達(dá)；核型正常為2n=44；去除飼養(yǎng)層和多能性維持因子后，兔類ESC可自然分化為脂肪樣細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、成纖維樣

6、細(xì)胞和跳動(dòng)的心肌細(xì)胞；懸滴培養(yǎng)8 d后可以形成擬胚體，分化14和21 d后，qPCR和免疫熒光檢測結(jié)果表明，組織特異性基因 Bmp4，Afp，Desmin，Sox17，Pax6和組織特異性蛋白VIMENTIN，β-TUBULIN，AFP，ALB，DESMIN的表達(dá)量隨分化時(shí)間延長而升高，說明兔類ESC可以向神經(jīng)、成纖維、肝臟、肌肉等細(xì)胞分化。將第3代兔類ESC注射到NOD-SCID小鼠腹股溝皮下，8周后可以形成具有神經(jīng)、肌肉、腺體等三胚