人尿液源性干細(xì)胞誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)嵴細(xì)胞模型的建立.pdf

1、目的：探究用于誘導(dǎo)尿液來(lái)源的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells from urine，UiPSCs）的尿液細(xì)胞是否為尿液源性干細(xì)胞（urine-derived stem cells, USCs），以及在無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)病毒的條件下通過(guò)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染非整合附著體質(zhì)粒載體將USCs重編程為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并由此分化為神經(jīng)嵴細(xì)胞的可

2、能，從而建立人尿液源性干細(xì)胞—誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)嵴細(xì)胞模型。
　　方法：按照UiPS技術(shù)中提取尿液細(xì)胞的方法，即用LONZA腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基提取并培養(yǎng)人的尿液細(xì)胞。擴(kuò)增后進(jìn)行多能性鑒定：流式細(xì)胞術(shù)鑒定USCs常見標(biāo)志物（CD34、CD45、CD29、CD73、CD146）的表達(dá)，以及分化為脂肪細(xì)胞、骨以及平滑肌細(xì)胞的能力。通過(guò)NucleofectorR Ⅱ細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀將質(zhì)粒pCXLE-EGF導(dǎo)入尿液細(xì)胞，觀察電轉(zhuǎn)后第1

3、周至第4周綠色熒光表達(dá)量的變化。同樣的方法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-EGFP、pCXLE-hSK以及pCXLE–hΜL，將尿液細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層以及無(wú)病毒的條件下重編程為iPSCs，并進(jìn)行iPSCs多能性鑒定。最后，將iPSCs向神經(jīng)嵴方向分化并通過(guò)定量PCR對(duì)神經(jīng)嵴標(biāo)志物（AP2、p75、HNK1、FoxD3）進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LONZA腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基提取并培養(yǎng)出的尿液細(xì)

4、胞USCs標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示陽(yáng)性標(biāo)志物CD29、CD73、CD146均為陽(yáng)性，其中CD29、CD73的表達(dá)率均>95％，陰性標(biāo)志物CD34、CD45均為陰性，表達(dá)率均<3%，符合尿液源性干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后通過(guò)油紅 O染色可見細(xì)胞內(nèi)含有大量紅染的脂滴。成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后，普通光學(xué)顯微鏡下即可見鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色后呈紅色。成平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)束后，定量PCR比較誘導(dǎo)前后平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物（SM-22α、SMMHC、

5、SM-α-actin和calopnin）表達(dá)量的變化，結(jié)果證實(shí)SM-22α、SM-α-actin和calopnin的表達(dá)量較誘導(dǎo)前顯著提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染pCXLE-EGFP一天后即可觀察到熒光表達(dá)，且熒光的表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減低。在無(wú)飼養(yǎng)層的條件下，本實(shí)驗(yàn)從4.8×105細(xì)胞中獲得37個(gè)克隆，重編程效率約為0.008%（出現(xiàn)的克隆數(shù)量/電轉(zhuǎn)的細(xì)胞數(shù)）。多能性鑒定顯示：堿性磷酸酶染色、免疫熒光（O

6、CT4、SOX2、NANOG、SSEA4）、流式細(xì)胞術(shù)（SSEA4、TRA-1-60）鑒定均為陽(yáng)性。擬胚體實(shí)驗(yàn)可見消化后懸浮培養(yǎng)的iPS細(xì)胞團(tuán)自行聚集成球形，且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，擬胚體球的體積越來(lái)越大，顏色越來(lái)越深，貼壁培養(yǎng)后可見有不同形態(tài)的細(xì)胞爬出。定量PCR鑒定各胚層標(biāo)志物基因表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示與未分化的人iPSCs相比，SOX17（內(nèi)胚層標(biāo)志物）、MSX1（中胚層標(biāo)志物）以及 MAP2（外胚層標(biāo)志物）的表達(dá)量均有顯著地提高（P<

7、0.05）?；チ鰧?shí)驗(yàn)證實(shí)此細(xì)胞具有在體內(nèi)環(huán)境下分化為三個(gè)胚層不同細(xì)胞的能力，如腺體（內(nèi)胚層）、肌肉(中胚層)、神經(jīng)管（外胚層）。向神經(jīng)嵴方向誘導(dǎo)分化后可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多改變?yōu)槿切位蛘叨嘟切危卸鄠€(gè)細(xì)而長(zhǎng)的突起，并相互連接形成網(wǎng)狀。以未分化的人iPSCs為對(duì)照組，定量PCR鑒定神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性標(biāo)志物（AP2、p75、HNK1、FoxD3）表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后特異性標(biāo)志物的表達(dá)較未分化的iP

8、SCs有顯著地提高（P<0.05），并且標(biāo)志物的表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高（P<0.05）。
　　結(jié)論：采用LONZA腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基提取的尿液細(xì)胞，不僅表達(dá)USCs常見的表面標(biāo)志物，而且具有與USCs相似的體外分化能力，也就是說(shuō)這種尿液細(xì)胞即為USCs。在無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)病毒的條件下，利用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染USCs可以獲得人的iPSCs，而且經(jīng)過(guò)小分子誘導(dǎo)可以分化為神經(jīng)嵴細(xì)胞，從而成功建立USCs來(lái)源的iPSCs分化而成的神經(jīng)嵴細(xì)胞模型