臨床級別人誘導的多潛能干細胞的建立與鑒定.pdf

1、在希臘神話中，泰坦巨人普羅米修斯因為受到宙斯的懲罰，肝臟不斷地被神鷹啄食。神奇的是他被啄食的肝臟可以不斷地再生，使得生命得以維持。現(xiàn)代社會，由于慢性病引起的組織器官衰竭或者意外事故引起的組織器官損傷病人越來越多。面對這類疾病，傳統(tǒng)的醫(yī)療手段往往顯得無能為力，人類急需把神話變?yōu)楝F(xiàn)實。再生醫(yī)學是研究用正常的細胞、組織或者器官替換受損的細胞、組織或器官行使功能或者用一定的手段誘導受損的細胞、組織或器官再生的學科，是未來醫(yī)學的一個重要研究方向。

2、細胞、組織或者器官的供體不足是限制再生醫(yī)學發(fā)展的重要因素之一。
　　人多潛能干細胞(human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)包括人胚胎干細胞(humanEmbryonic Stem cells，hESCs)和人誘導的多潛能干細胞(human induced Pluripotent StemCells，hiPSCs)，具有無限的增殖能力和分化形成機體內所有細胞類型的潛能，理論上來說可以源源不斷的為再生醫(yī)

3、學提供各種類型的細胞、組織和器官，應用前景巨大。自從Thomson實驗室建立了第一株hESCs以來，科學家就一直在HPSCs的臨床應用這條道路上不斷地探索，并取得了一系列的成果。但是hESCs是從發(fā)育早期的人類胚胎中建系獲取的，涉及到了倫理道德問題，其科學研究和臨床應用一直備受爭議。hiPSCs是通過一定的手段（導入外源基因或者使用化學小分子）將體細胞重編程獲得的，和hESCs具有相同的特性和臨床應用價值，并且能規(guī)避hESCs所涉及到的

4、倫理問題。
　　重編程效率低下，外源基因隨機整合和自發(fā)激活，動物源性物質的使用，基因組和表觀遺傳學的穩(wěn)定性等是影響hiPSCs臨床應用的重要問題。隨著科學研究的深入，這些問題也正在被逐步解決，hiPSCs的臨床應用時機已經(jīng)趨于成熟。日本科學家正在用hiPSCs分化形成的視網(wǎng)膜色素上皮細胞（Retinal Pigmented Epithelial cells，RPE）進行治療年齡相關性黃斑變性的臨床試驗。到目前為止，接受細胞移植的患

5、者沒有出現(xiàn)不良反應，視力有所改善。
　　為了保證臨床應用的合法性、安全性、有效性和可追溯性，臨床應用的hiPSCs應該滿足以下幾點要求:
　　(1)供體細胞捐獻過程符合《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》和《組織捐獻條例》中的相關規(guī)定及倫理道德規(guī)范;
　　(2)供體細胞取材方便;
　　(3)在臨床應用過程中，難免會涉及到一些年紀較大個體細胞的重編程，細胞供體的年齡越大，細胞越不容易被重編程，為了保證成功

6、率，應該選擇高效的重編程方法;
　　(4)為了避免外源基因隨機整合到基因組中引起的插入突變和外源基因自發(fā)激活導致的致瘤性，以臨床應用為目的的hiPSCs應該不含有外源重編程因子;
　　(5)國際上的干細胞協(xié)會和大多數(shù)國家都要求或者鼓勵臨床應用細胞的操作規(guī)程符合優(yōu)良制造標準（Good Manufacturing Practice，GMP），所以從供體細胞的采集，hiPSCs的誘導到hiPSCs的定向分化等操作流程和制造環(huán)境都應

7、該符合GMP標準;
　　(6)為了避免動物源性病原體在人畜之間交叉?zhèn)鞑?，在以臨床應用為目的的細胞培養(yǎng)過程中最好要避免動物源性成分的添加;
　　(7)對于以臨床應用為目的的細胞，我們要做細菌、真菌、支原體、一些特殊種類病原體的檢測，確保其具有生物安全性。
　　雖然目前世界上有一些臨床級別hiPSCs的報道，但是在這些研究中，科學家基本上都是將研究級別的hiPSCs通過在無動物源性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉化成所謂的臨床級別的hiP

8、SCs，或者是將研究級別的供體細胞通過在無動物源性的培養(yǎng)液中重編程，獲得所謂的臨床級別的hiPSCs。所獲得的hiPSCs都與含有動物源性的培養(yǎng)液接觸過，給其臨床應用增加了潛在動物源性病原體感染的風險。在僅有的一項完全從無動物源性培養(yǎng)液中建系的hiPSCs的報道中，研究者沒有對其生物安全性進行檢測，也沒有描述供體細胞的捐獻過程是否符合《組織捐獻條例》。所以以符合《組織捐獻條例》細胞為供體細胞，在無動物源性的培養(yǎng)液中和符合GMP操作規(guī)范和

9、環(huán)境下從頭建立臨床級別的hiPSCs并對其進行全面的生物安全性檢測對于hiPSCs更加安全有效和規(guī)范的應用于臨床是十分必要的。
　　基于臨床用hiPSCs的基本要求和目前臨床級別hiPSCs的研究現(xiàn)狀，我們進行了以下研究:
　　(1)初步用慢病毒體系優(yōu)化取材方便的人臍帶血單個核細胞(human Umbilical CordBlood Mononuclear Cells, hUCBMCs)重編程為hiPSCs的流程，提高其重編

10、程效率和成功率;
　　(2)在不使用原癌基因C-Myc的情況下，優(yōu)化用攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質粒誘導hiPSCs的方法，高效穩(wěn)定獲得不攜帶外源基因的hiPSCs;
　　(3)在前期優(yōu)化重編程方法的研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同個體來源的人體細胞的重編程效率不同，這種效率的差異和供體的年齡無關。對這些細胞進行RNA-Seq測序，并對其基因表達譜進行分析，找出了不同個體來源的人體細胞重編程效率不同的機

11、制;
　　(4)基于以上探索，最后，以符合《組織捐獻條例》的人包皮成纖維細胞為供體細胞，在符合GMP環(huán)境規(guī)范和操作規(guī)范的條件下和Xeno-free培養(yǎng)液中從頭建立非整合型臨床級別hiPSCs，并對其細胞特性，分化能力和生物安全性做全面檢測。
　　上述研究結果表明:
　　(1)在重編程之前，將懸浮生長的hUCBMCs接種到包被MesenCult-XF基質的培養(yǎng)皿中，使其轉化成貼壁生長狀態(tài);在重編程的過程中，用向貼壁不牢固

12、的供體細胞中加飼養(yǎng)層細胞的方式取代將供體細胞消化下來接種到飼養(yǎng)層細胞上的方式，提高供體細胞貼壁和存活效率;能大幅度提高hUCBMCs的重編程效率和成功率;
　　(2)在采用效率比較高的電轉染方法將質粒轉染到供體細胞中的情況下，在重編程過程中使用重編程效率比較高的X培養(yǎng)液的前提下，攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質粒(PCEP4-OSKN)能夠高效重編程HFF-21WF細胞，誘導效率顯著高于已經(jīng)報道的不含

13、有C-Myc等原癌基因的非整合型質粒的重編程效率，并且可以在不使用任何和表觀遺傳學調控相關小分子的情況下誘導獲得hiPSCs;
　　(3)攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質粒(PCEP4-OSKN)不能成功重編程臍帶間充質干細胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUCMSCs)和其它個體來源的HFF細胞;
　　(4)對四個不同個體來源的HFF

14、細胞（HFF-21WF，HFF-19WM，HFF-16 WM和HFF-6Y）和一個個體來源的hUCMSCs(UCMSC-21WF)進行RNA-Seq測序，數(shù)據(jù)分析結果表明，能被PCEP4-OSKN重編程的HFF細胞和不能夠被PCEP4-OSKN重編程的細胞基因表達差異主要集中在細胞連接分子和TGFβ信號通路上;
　　(5)以符合《組織捐獻條例》的在Xeno-free培養(yǎng)液中和符合GMP操作規(guī)范和環(huán)境規(guī)范的條件下原代和傳代培養(yǎng)的人包