幾種抗炎藥物在人角質(zhì)形成細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作用位點(diǎn)的研究.pdf

1、一類(lèi)以銀屑病和變應(yīng)性接觸性皮炎為代表的慢性炎癥性皮膚病,是當(dāng)前皮膚科研究重點(diǎn)之一。這類(lèi)疾病以密集的活化T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征,T淋巴細(xì)胞釋放淋巴因子,影響角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫功能,而皮膚又為T(mén)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和維持提供了一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境,皮膚浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用在這類(lèi)炎癥性皮膚病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這類(lèi)疾病以Th1淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),IFN-γ是Th1淋巴細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一,也是調(diào)節(jié)皮膚炎癥和免疫

2、反應(yīng)最有效的促炎因子,這類(lèi)炎癥反應(yīng)也被稱為IFN-γ依賴性炎癥反應(yīng)。角質(zhì)形成細(xì)胞是IFN-γ作用的主要靶細(xì)胞,IFN-γ活化角質(zhì)形成細(xì)胞,使其表達(dá)許多趨化因子、細(xì)胞因子和膜分子,指導(dǎo)相應(yīng)的特殊細(xì)胞亞群募集至皮膚并使他們活化,參與并放大炎癥反應(yīng)。在這些眾多趨化因子中,IL-8負(fù)責(zé)募集多形核中性粒細(xì)胞在表皮內(nèi)聚集,ICAM-1參與角質(zhì)形成細(xì)胞與炎性細(xì)胞間的黏附。因此,對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究,有助于對(duì)Th1占優(yōu)勢(shì)的皮膚炎癥

3、反應(yīng)提出合理治療方法,以及有助于新型抗炎藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。
　　 他克莫司(FK-506)是通過(guò)系統(tǒng)應(yīng)用或外用的免疫抑制、抗炎藥物；雷公藤通過(guò)口服發(fā)揮抗免疫、抗炎作用；丙酸氯倍他索屬外用糖皮質(zhì)激素；鹽酸13-己基小檗堿(HB-13)和鹽酸13-己基巴馬汀(HP-13)是局部外用具有顯著抗炎作用的新化合物。本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞永生化株HaCaT細(xì)胞為研究體系,以上述藥物為目標(biāo)藥物,研究藥物對(duì)HaCaT細(xì)胞中IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的

4、影響。
　　 第一章藥物對(duì)IFN-γ上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞IL-8分泌及ICAM-1表達(dá)的影響：
　　 通過(guò)ELISA法測(cè)定藥物對(duì)IFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞IL-8分泌的影響；Cell-ELISA法測(cè)定藥物對(duì)IFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:HaCaT細(xì)胞在自然狀態(tài)下能分泌IL-8,rhIFN-γ刺激可以上調(diào)HaCaT細(xì)胞IL-8的分泌水平。FK-506、HB-13和HP-13對(duì)IFN-γ

5、上調(diào)的IL-8分泌均有劑量依賴性的抑制作用,IC50值分別為0.0076μg/mL、0.269μg/mL和0.365μg/mL。HaCaT細(xì)胞在自然狀態(tài)下能表達(dá)ICAM-1,500U/mL,rhIFN-γ刺激后表達(dá)升高,表達(dá)在刺激6h達(dá)到高峰。FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、丙酸氯倍他索、HB-13和HP-13對(duì)IFN-γ刺激下HaCaT細(xì)胞表面黏附分子ICAM-1表達(dá)分別有劑量依賴性的抑制作用,IC50值分別為0.86μg/mL、2.10

6、×10-4μg/mL、0.024μg/mL、0.279μg/mL、0.268μg/mL。本章結(jié)果表明,FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、丙酸氯倍他索、HB-13和HP-13對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子和黏附分子有明顯抑制作用。
　　 第二章藥物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中IFN-γRα表達(dá)的影響：
　　 通過(guò)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞,外源性rhIFN-γ作為刺激劑,用Western blotti

7、ng法研究rhIFN-γ刺激HaCaT細(xì)胞后IFN-γRα表達(dá)情況,同時(shí)研究藥物對(duì)rhIFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞IFN-γRα表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:HaCaT細(xì)胞在自然狀態(tài)下可表達(dá)少量的IFN-γRα,在500U/mL rhIFN-γ,刺激HaCaT細(xì)胞5min后,IFN-γRα表達(dá)即可上調(diào),刺激后的高表達(dá)狀態(tài)可持續(xù)至少2h；250～1000U/mL rhIFN-γ均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞IFN-γRa表達(dá),各濃度組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

8、異；FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索預(yù)處理2h可抑制500U/mL rhIFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞IFN-γRα表達(dá),IC50值分別為0.43μg/mL、4.94×10-3μg/mL、0.351μg/mL、2.190μg/mL及0.061μg/mL。本章結(jié)果表明,用500U/ml rhIFN-γ誘導(dǎo)5min后可使HaCaT細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中IFN—γRα蛋白穩(wěn)定表達(dá)；FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、

9、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索通過(guò)抑制rhIFN-γ誘導(dǎo)的IFN-γRα表達(dá)從而抑制IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動(dòng)。
　　 第三章藥物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中JAK2磷酸化的影響：
　　 通過(guò)Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT細(xì)胞后磷酸化JAK2(pJAK2)表達(dá)情況,并采用Western blotting法研究藥物對(duì)rhIFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞pJAK2表達(dá)的影響。結(jié)

10、果顯示:未經(jīng)刺激的HaCaT細(xì)胞不表達(dá)pJAK2,500U/mL rhIFN-γ刺激5min即可誘導(dǎo)表達(dá),刺激15min后則不能檢測(cè)到pJAK2表達(dá)；250～1000U/mLrhIFN-γ均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞pJAK2表達(dá),各濃度組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索預(yù)處理2h可抑制500U/mLrhIFN-γ誘導(dǎo)的pJAK2表達(dá),IC50值分別為0.224μg/mL、1.02×10-

11、3μg/mL、0.386μg/mL、2.049μg/mL、0.095μg/mL。本章結(jié)果表明,用500U/ml rhIFN-γ誘導(dǎo)5min后可使HaCaT細(xì)胞中pJAK2蛋白穩(wěn)定表達(dá)；FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索通過(guò)抑制JAK2磷酸化,而阻斷IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 第四章藥物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中STAT-1磷酸化的影響：
　　 通過(guò)Western blotting

12、法研究rhIFN-γ刺激HaCaT細(xì)胞后pSTAT-1表達(dá)情況,同時(shí)研究藥物對(duì)rhIFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞磷酸化STAT-1(pSTAT-1)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:未經(jīng)刺激的HaCaT細(xì)胞不能表達(dá)pSTAT-1,500U/ml rhIFN-γ刺激5min后,pSTAT1表達(dá)即可被誘導(dǎo),這種被誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)可持續(xù)至少2h；250～1000U/mLrhIFN-γ均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞pSTAT-1表達(dá),各濃度組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。FK

13、-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索預(yù)處理2h可抑制500U/mLrhIFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞pSTAT-1表達(dá),IC50值分別為0.95μg/mL、4.64×10-4μg/mL、0.303μg/mL、2.10μg/mL和0.609μg/mL。本章結(jié)果表明,用500U/ml rhIFN-γ誘導(dǎo)后30min可使HaCaT細(xì)胞中pSTAT-1蛋白穩(wěn)定表達(dá)；FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸

14、氯倍他索通過(guò)抑制rhIFN-γ誘導(dǎo)的STAT-1磷酸化從而抑制IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 第五章藥物對(duì)HaCaT細(xì)胞IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中SOCS-1表達(dá)的影響：
　　 通過(guò)Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT細(xì)胞后SOCS-1表達(dá)情況,同時(shí)研究藥物對(duì)rhIFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞SOCS-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:未經(jīng)活化的HaCaT細(xì)胞低水平表達(dá)SOCS-1,500U/ml rhIF

15、N-γ刺激30min后,SOCS-1表達(dá)顯著增加,高表達(dá)狀態(tài)可持續(xù)4h以上。250～1000U/mL rhIFN-γ均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞SOCS-1表達(dá)增加,各濃度組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。FK-506、雷公藤內(nèi)酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索預(yù)處理2h可上調(diào)IFN-γ刺激的HaCaT細(xì)胞SOCS-1表達(dá),ED50值分別為0.015μg/mL、1.10×10-5μg/mL、0.051μg/mL、1.777μg/mL、0.29μ