新型天然產(chǎn)物EPLE抗結(jié)直腸癌及NMHC抗白血病的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分新型對(duì)映貝殼杉烷型二萜EPLE抗結(jié)直腸癌的作用及機(jī)制研究
　　目的：結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率極高的惡性腫瘤。盡管早期結(jié)直腸癌通過(guò)外科切除可取得較好的療效，但由于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌化療、放療效果都不明顯，目前仍沒(méi)有理想的治療方法。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與結(jié)直腸癌的發(fā)生有著密切關(guān)系，這一部分工作研究從貴州鼠尾草中分離得到的對(duì)映貝殼杉烷型二萜類(lèi)新型小分子化合物（EPLE）通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信

2、號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用及其機(jī)制。
　　方法：以多種結(jié)直腸癌細(xì)胞株、患者原代樣本和小鼠異源移植模型為研究對(duì)象，采用細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)，研究EPLE抗腫瘤的機(jī)制。采用MTT法及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物對(duì)多種結(jié)直腸癌細(xì)胞的毒性作用；運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡以及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因的mRNA表達(dá)水平變化；構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)

3、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性變化。我們還采用免疫共沉淀的方法檢測(cè)EPLE對(duì)β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成的阻斷作用；計(jì)算機(jī)模擬EPLE阻斷β-catenin/TCF4相互作用的結(jié)構(gòu)圖示。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)裸鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤模型，檢測(cè)EPLE對(duì)移植瘤生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果： EPLE可特異性抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞系及原代腫瘤樣本的增殖而對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用且呈良好的

4、劑量及時(shí)間依賴(lài)性。EPLE可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。機(jī)制研究顯示EPLE直接靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路，阻斷β-catenin/TCF4復(fù)合物的形成，抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因的表達(dá)。EPLE與現(xiàn)有的結(jié)直腸癌化療藥物五氟尿嘧啶聯(lián)合使用具有一定的協(xié)同作用，而且單獨(dú)使用即可抑制結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：EPLE對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有顯著而特異性的細(xì)胞毒作用，通過(guò)直

5、接抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，阻斷β-catenin與TCF4的相互作用，抑制TCF4/?-catenin轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性，而發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　第二部分新型石蒜科生物堿NMHC抗急性髓細(xì)胞白血病的作用及機(jī)制研究
　　目的：急性髓細(xì)胞白血病(AML)表現(xiàn)為骨髓中造血干細(xì)胞的惡性增殖，是一種常見(jiàn)的惡性血液腫瘤，近年來(lái)盡管聯(lián)合化療和造血干細(xì)胞移植取得了較大的進(jìn)展,但大多數(shù)患者仍然死于耐藥、復(fù)發(fā)或并發(fā)癥，因此臨床急

6、需尋找更加有效的治療藥物。最新病理機(jī)制研究表明 NOTCH信號(hào)通路的激活在 AML中表現(xiàn)為腫瘤抑制的活性。本實(shí)驗(yàn)主要研究石蒜科蔥蓮屬植物蔥蓮中提取的生物堿NMHC對(duì)AML的抗腫瘤藥效及其作用機(jī)制，可能為將來(lái)有效治療AML提示新思路。
　　方法：以多種白血病細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用CCK8法檢測(cè)受試藥物NMHC對(duì)白血病細(xì)胞的毒性，流式細(xì)胞技術(shù)與蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) NMHC對(duì)AML細(xì)胞周期和凋亡的影響。為深入探索化合物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的

7、分子機(jī)制，我們進(jìn)行了全基因組表達(dá)譜基因芯片分析和KEGG信號(hào)通路基因的富集分析，并通過(guò)熒光定量 PCR、雙熒光素酶報(bào)告基因和免疫印跡的方法驗(yàn)證 NMHC處理后NOTCH1靶基因的表達(dá)變化。進(jìn)一步在AML細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)MAML的負(fù)顯性形式DNMAML以專(zhuān)一性的阻斷NOTCH信號(hào)，通過(guò)追蹤GFP表達(dá)百分比檢測(cè)內(nèi)源性阻斷NOTCH能否能挽救NMHC引起的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)受試藥物NMHC可顯著抑制髓系細(xì)胞白血病的增殖并誘導(dǎo)細(xì)

8、胞凋亡，而對(duì)淋巴細(xì)胞白血病的毒性較弱。全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，NMHC處理后NOTCH信號(hào)通路的相關(guān)基因明顯上調(diào)，提示NMHC能激活NOTCH信號(hào)通路。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NMHC可有效促進(jìn) NOTCH下游靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)活性形式ICN的蛋白表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明NMHC處理后能直接激活I(lǐng)CN的轉(zhuǎn)錄。而且，NMHC與NOTCH激活多肽DLL4聯(lián)用對(duì)下游靶基因的激活具有協(xié)同作用，通過(guò)表達(dá)負(fù)顯性形式DNMAML阻斷NOTCH信號(hào)通