β-七葉皂苷抗白血病作用研究及分子機(jī)理探討.pdf

1、近年來(lái)，有關(guān)β-七葉皂苷抗腫瘤活性已有所報(bào)道：鄒明、郭維等研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷具有抑制人鼻咽癌細(xì)胞KB、小鼠肝癌細(xì)胞H22、小鼠肉瘤細(xì)胞S180及大腸癌HCT-8細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，PatlollaJM等報(bào)道β-七葉皂苷能夠抑制小鼠ACF(結(jié)腸癌癌前病變)的形成，以及誘導(dǎo)HT-29人克隆結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。但有關(guān)β-七葉皂苷抗白血病作用的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)旨在從細(xì)胞藥效、整體動(dòng)物藥效和分子作用機(jī)理探討的角度，多層次、多水平地

2、研究β-七葉皂苷的抗白血病作用，為開(kāi)發(fā)該藥成為治療白血病新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為尋找、發(fā)現(xiàn)和合成新型抗癌先導(dǎo)化合物提供有用線索。 實(shí)驗(yàn)所用β-七葉皂苷凍干粉針，為山東煙臺(tái)綠葉制藥有限公司產(chǎn)品，從七葉樹科中國(guó)天師栗(AesculuswilsoniiRebd)干燥成熟果實(shí)娑羅子(SemenAesculi)中提取；阿霉素為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。人急性髓細(xì)胞白血病(humanacutemyelogenousleukemia)

3、細(xì)胞株HL-60、人慢性髓細(xì)胞白血病(humanchronicmylogenousleukemia)細(xì)胞株K562及小鼠急性淋巴細(xì)胞白血病(murinelymphoidleukemia)細(xì)胞株P(guān)388和L1210由中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供。DBA/2近交小鼠，體重18-22g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 我們采用半固體集落培養(yǎng)法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察β-七葉皂苷對(duì)HL-60和K562細(xì)胞的體外增殖抑制作用，采用MTT法觀察

4、β-七葉皂苷對(duì)P388細(xì)胞的體外增殖抑制作用；并建立P388和L1210小鼠淋巴細(xì)胞白血病移植模型觀察β-七葉皂苷對(duì)體內(nèi)荷瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率和小鼠腹水變化；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以HL-60和K562為靶細(xì)胞，采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法、DNA片斷(DNAladder)分析以及流式細(xì)胞儀分析DNA含量等方法觀察β-七葉皂苷對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，以探討其分子作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS10.0forw

5、indows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，兩組間差異比較采用Student'St檢驗(yàn)，多組資料之間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。IC50應(yīng)用GWBASIC(LOGIT)軟件非線性回歸計(jì)算獲得。 細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：30μg/ml的β-七葉皂菅作用于K562細(xì)胞24、48和72h后，CFU-K562集落形成百分率分別為76.5±7.6％，49.5±5.4％和33.2±4.7％，與對(duì)照組的100％相比，具有明

6、顯的抑制作用(P＜0.05)；50μg/ml的β-七葉皂苷作用于K562細(xì)胞24、48和72h，CFU-K562集落形成百分率分別為30.5±5.2％，19.8±4.6％和11.2±3.6％，與對(duì)照組的100％相比，具有明顯的抑制作用(P＜0.01)。高濃度(70μg/ml)的β-七葉皂苷作用于K562細(xì)胞24、48和72h，CFU-K562集落形成百分率接近零及等于零。低濃度(10μg/ml)的β-七葉皂苷對(duì)CFU-K562集落的形成

7、沒(méi)有影響。K562細(xì)胞與10，30和50μg/ml的β-七葉皂苷共同孵育24、48和72h后，細(xì)胞活率無(wú)明顯影響，但高濃度(70μg/ml)的β-七葉皂苷，使K562細(xì)胞活率明顯下降，從原來(lái)的97.5±2.5％降到50％以下，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒活性。 30μg/ml的β-七葉皂苷作用于HL-60細(xì)胞24、48和72h后，CFU-HL-60集落形成百分率分別為68.5±5.4％，45.2±4.9％and33.2±5.7％，與對(duì)照組的

8、100％相比，具有明顯的抑制作用(P＜0.05)；50μg/ml的β-七葉皂苷作用于HL-60細(xì)胞24、48和72h，CFU-HL-60集落形成百分率分別為35.5±4.1％，27.8±3.2％and16.2±2.9％，與對(duì)照組的100％相比，具有明顯的抑制作用(P＜0.01)。高濃度(70μg/ml)的β-七葉皂苷作用于HL-60細(xì)胞24、48和72h，CFU-HL-60集落形成率百分接近零及等于零。低濃度(10μg/ml)的β-七葉

9、皂苷對(duì)CFU-HL-60集落的形成沒(méi)有影響。HL-60細(xì)胞與10，30和50μg/ml的β-七葉皂苷共同孵育24、48和72h后，細(xì)胞活率無(wú)明顯影響，但高濃度(70μg/ml)的β-七葉皂苷，使HL-60細(xì)胞活率明顯下降，從原來(lái)的97.8±2.1％降到50％以下，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒活性。β-七葉皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的P388細(xì)胞也具有增殖抑制作用，并呈明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。β-七葉皂苷作用P388細(xì)胞72小時(shí)IC50為23.15±4

10、.61μg/ml，與阿霉素聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。 整體動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：β-七葉皂苷對(duì)P388小鼠淋巴細(xì)胞白血病移植模型具有延長(zhǎng)生命期作用，高(4.5mg/kg)、中(3.5mg/kg)、低.(2.5mg/kg)劑量組對(duì)DBA/2近交小鼠移植性腫瘤的生命延長(zhǎng)率分別為23.5％、29.4％和17.6％，其中高、中劑量組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)；阿霉素與β-七葉皂苷低劑量聯(lián)合用藥治療組，生命延長(zhǎng)率為47.1％

11、與阿霉素治療組(2mg/kg)的29.4％相比具有顯著性差異(P＜0.01)。β-七葉皂苷對(duì)L1210小鼠淋巴細(xì)胞白血病移植模型也具有明顯的延長(zhǎng)生命期作用，高(4.5mg/kg)、中(3.5mg/kg)、低(2.5mg/kg)劑量組對(duì)DBA/2近交小鼠移植性腫瘤的生命延長(zhǎng)率分別為25.8％、32.3％和12.9％，其中高、中劑量組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)；阿霉素與β-七葉皂苷低劑量聯(lián)合用藥治療組，生命延長(zhǎng)率為45.2％

12、與阿霉素治療組(2mg/kg)的29.0％相比具有顯著性差異(P＜0.01)。 分子機(jī)理探討結(jié)果顯示：30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用于K562細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)明顯的凋亡特征；AnnexinV-FITC分析結(jié)果顯示K562細(xì)胞經(jīng)30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用24h后，AnnexinV+和PI-(早期凋亡)細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的29.61±3.11％和40.71±4.32％，與對(duì)照組的1.58±0.97％相比

13、結(jié)果具有顯著差異(P＜0.05)。DNA片斷(DNAladder)分析結(jié)果顯示30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用于K562細(xì)胞48和72h后，瓊脂糖凝膠電泳顯示180bp倍數(shù)的DNAladder；DNA含量分析結(jié)果顯示K562細(xì)胞經(jīng)30和50μg/mlβ-七葉皂苷作用48h后，流式細(xì)胞儀直方圖可見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡小峰Ap，即Sub-G1期細(xì)胞，分別占細(xì)胞總數(shù)的11.2±1.6％和33.2±3.1％，與對(duì)照組的1.3±0.6％相比具有顯

14、著性差異(P＜0.05)，同時(shí)伴隨有G1-S期細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。 30μg/ml的β-七葉皂苷作用于HL-60細(xì)胞24、48和72h后，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)明顯的凋亡特征；AnnexinV-FITC分析結(jié)果顯示HL-60細(xì)胞經(jīng)20、30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用24h后，AnnexinV+和PI-(早期凋亡)細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的19.61±3.15％、55.15±5.11％和46.91±6.21％，與對(duì)照組的1.15±0.95％

15、相比結(jié)果具有顯著差異(P＜0.05)。DNA片斷(DNAladder)分析結(jié)果顯示20、30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用于HL-60細(xì)胞48h后，瓊脂糖凝膠電泳顯示180bp倍數(shù)的DNAladder；DNA含量分析結(jié)果顯示HL-60細(xì)胞經(jīng)30和50μg/ml的β-七葉皂苷作用48h后，流式細(xì)胞儀直方圖可見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡小峰Ap，即Sub-G1期細(xì)胞，分別占細(xì)胞總數(shù)的21.8±3.6％和42.4±4.5％，與對(duì)照組的1.2±0.2％

16、相比具有顯著性差異(P＜0.05)，同時(shí)伴隨有G1-S期細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。 綜上所述，β-七葉皂苷(Beta-escin，aescin)，一種從七葉樹科中國(guó)天師栗(AesculuswilsoniiRebd)干燥成熟果實(shí)娑羅子(SemenAesculi)提取的天然三萜皂苷類化合物，對(duì)HL-60人急性髓性白血病細(xì)胞、K562人慢性髓性白血病細(xì)胞和P388小鼠急性淋巴白血病細(xì)胞均具有較強(qiáng)的體外增殖抑制作用，作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性