人TLR9受體胞外段識別CpG DNA的LRR序列和胞內(nèi)段新功能的實驗研究.pdf

1、目的: 本課題深入分析TLR9胞外段與胞內(nèi)段空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性；應(yīng)用細(xì)菌生長抑制實驗推測LRRs在識別CpG DNA中的作用；合成LRR多肽，觀察其與CpG DNA的親合力以及生物學(xué)活性；為明確TLR9與CpG DNA結(jié)合位點、闡明TLR9識別機制奠定基礎(chǔ)。 方法： 一、TLR9胞外段與CpG DNA識別、結(jié)合LRR序列的確定 (一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大腸桿菌中的表達 構(gòu)

2、建含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的原核表達pET28系列載體，在大腸桿菌中IPTG誘導(dǎo)表達相應(yīng)的蛋白。 (二)利用細(xì)菌生長變化推測TLR9胞外段與CpG DNA結(jié)合位點 含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的pET28和pQE30原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)或M15感受態(tài)，1 mM IPTG分別誘導(dǎo)8h，并在第0h、2h、4h、6h、8h分別取菌液測定細(xì)菌OD600，繪制生長曲線。

3、 (三)應(yīng)用生物傳感器技術(shù)檢測LRR多肽與CpG DNA親和力 人工合成LRR2、5、8、11多肽，將生物素標(biāo)記的CpG DNA包被于生物素化樣品池，利用生物傳感器檢測各個LRR多肽與CpG DNA的親和力，結(jié)果以結(jié)合峰值表示。在此基礎(chǔ)上，測量、計算LRR多肽與CpG DNA的解離常數(shù)Kd值。 (四)應(yīng)用細(xì)胞因子釋放抑制實驗觀察LRRs在結(jié)合CpG DNA中的作用 分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，加入48孔板中，每孔5×

4、106個細(xì)胞，培養(yǎng)4h，預(yù)先準(zhǔn)備各LRR多肽與CpG DNA的混合物，加入培養(yǎng)孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取培養(yǎng)上清，ELISA法檢測TNF-α含量。 (五)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)化實驗觀察LRRs對CpG DNA在細(xì)胞中聚集的影響 分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，加入24孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同的6-FAM標(biāo)記的CpG DNA與LRR多肽的混合物后，培養(yǎng)1 h，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強度的變化。 對各多肽進行理論分析，計算多肽

5、的各種理化參數(shù)，如分子量、等電點、氨基酸構(gòu)成、原子組成等。 二、TLR9胞內(nèi)段抑菌作用的發(fā)現(xiàn)和實驗研究 (一)TLR9胞內(nèi)段CT序列在大腸桿菌中的表達 構(gòu)建含有TLR9跨膜段、胞內(nèi)段的pQE30-CT載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達，Wester-blot法進一步確定目的蛋白的特異性。 (二)IPTG誘導(dǎo)對pQE30-CT轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長的影響 1.1.0 mM I

6、PTG誘導(dǎo)對pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌生長的影響 擴增pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌至OD600為0.3左右，1 mM IPTG分別誘導(dǎo)8h，并在第0h、2h、4h、6h、8h分別取菌液測定細(xì)菌OD600，繪制生長曲線。 2.不同濃度IPTG誘導(dǎo)對pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌生長的影響 3.pQE30-CT載體不同表達宿主菌的生長變化 4.不同起始誘導(dǎo)細(xì)菌濃度對IPTG誘導(dǎo)后生長的影響 5.含抗生素LB

7、培養(yǎng)液對M15-pQE30-CT菌株誘導(dǎo)后生長的影響 分別使用了含雙抗LB培養(yǎng)液和不含雙抗LB培養(yǎng)液，觀察M15-pQE30-CT菌株經(jīng)1.0 mM IPTG誘導(dǎo)后生長變化。 6.M15-pQE30-CT菌株IPTG誘導(dǎo)24 h生長曲線 7.M15-pQE30-CT誘導(dǎo)后超聲上清對大腸桿菌ATCC35218生長的影響 8.M15-pQE30-CT與大腸桿菌ATCC35218菌懸液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長變化

8、 9.M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌形態(tài)變化 (三)IPTG誘導(dǎo)對含有不同區(qū)域片段pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌株生長的影響 將CT段進行分解，共分成TM、CD、CT1、CT2以及CT3，分別構(gòu)建載體觀察轉(zhuǎn)化菌生長曲線。 結(jié)果： 一、TLR9胞外段與CpG DNA識別、結(jié)合LRR序列的確定 (一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大腸桿菌中的表達 pET28-LR

9、R8轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有明顯目的蛋白表達，而其它載體如pET28-LRR2、pET28-LRR5以及pET28-LRR11轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后未見相應(yīng)的蛋白條帶。 pET28-LRR2、pET28-LRR11轉(zhuǎn)化菌在IPTG誘導(dǎo)6 h后，與未誘導(dǎo)組相比細(xì)菌數(shù)量顯著減少，而轉(zhuǎn)化pET28-LRR8的細(xì)菌未見此現(xiàn)象。 (二)利用細(xì)菌生長變化推測TLR9胞外段與CpG DNA結(jié)合位點 pET28a-LRR5轉(zhuǎn)化菌在IP

10、TG誘導(dǎo)后生長曲線無明顯變化，而轉(zhuǎn)化有pET28a-LRR11、pET28a-LRR2、pET28a-LRR8的BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長明顯受到抑制。 (二)應(yīng)用生物傳感器技術(shù)檢測LRR多肽與CpG DNA親和力 在LRR2、LRR5、LRR8、LRR11這4個多肽中，LRR11與CpG DNA2006的親和力最高，LRR8與CpG DNA2006之間幾無親合力，LRR2和LRR5與CpG DNA2006的親合力

11、約為LRR11與CpG DNA2006親合力的1/4～1/5。 (四)應(yīng)用細(xì)胞因子釋放抑制實驗觀察LRRs在結(jié)合CpG DNA中的作用 4個多肽片段提前與CpG DNA孵育后，LRR8幾乎沒有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的能力，而LRR11抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的能力最強。 (五)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)化實驗觀察LRRs對CpG DNA在細(xì)胞中聚集的影響 LRR5、LRR8和LRR11能

12、增加6-FAM CpG DNA在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光強度，各組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強度增加分別為27.3％、32.0％和69.2％。LRR11多肽能顯著6-FAM CpG DNA在細(xì)胞內(nèi)聚集，且呈明顯的量效關(guān)系。 二、TLR9胞內(nèi)段抑菌作用的發(fā)現(xiàn)和實驗研究 (一)TLR9胞內(nèi)段CT序列在大腸桿菌中的表達 構(gòu)建了含有TLR9跨膜段、胞內(nèi)段的pQE30-CT載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，經(jīng)Western-blot檢測，

13、發(fā)現(xiàn)該載體菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能微量表達目的蛋白。 二)IPTG誘導(dǎo)對pQE30-CT轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長的影響 1.M15-pQE30-CT帶有TLR9的跨膜段和胞內(nèi)段TIR全序列，經(jīng)1 mM IPTG誘導(dǎo)后，在各個時間段細(xì)菌生長均受到非常顯著的抑制。 2.M15-pQE30-CT，經(jīng)0.1 mM、0.3 mM、1.0 mM、3.0 mM IPTG誘導(dǎo)后，在各個時間段細(xì)菌生長均受到非常顯著的抑制，不同濃度IPTG組細(xì)菌

14、生長曲線幾乎完全重合。 3.將pQE30-CT轉(zhuǎn)化DH5α菌株，1 mM IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后pQE30-CT DH5α轉(zhuǎn)化菌在各個時間段均受到明顯抑制。 4.將M15-pQE30-CT菌株擴增至OD值2.0時用1.0 mM IPTG誘導(dǎo)2 h，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)組細(xì)菌OD值明顯下降，結(jié)果證實起始誘導(dǎo)細(xì)菌濃度不影響M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長抑制狀態(tài)。 5.在含有雙抗和不含雙抗的LB培養(yǎng)液條件下，細(xì)

15、菌誘導(dǎo)后生長均受到非常顯著抑制，排除抗生素對其的影響。 6.未誘導(dǎo)組細(xì)菌在第10 h達到生長平臺期，IPTG誘導(dǎo)組細(xì)菌在前10 h內(nèi)處于抑制狀態(tài)，但從第10h開始恢復(fù)生長，直至第20 h達到平臺期。 7.M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲上清不影響大腸桿菌ATCC35218生長。 8.M15-pQE30-CT和大腸桿菌ATCC35218不同比例菌懸液經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，除了單獨M15-pQE30-CT組

16、細(xì)菌生長受到抑制外，其余各組細(xì)菌生長無顯著差異。說明M15-pQE30-CT細(xì)菌誘導(dǎo)后不能釋放能抑制其它細(xì)菌生長的蛋白。 9.未誘導(dǎo)組M15-pQE30-CT細(xì)菌革蘭染色后，細(xì)胞形態(tài)清晰、完整，無聚團現(xiàn)象，經(jīng)1.0 mM IPTG誘導(dǎo)2 h后，鏡下細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞形態(tài)不完整、模糊。 (三)IPTG誘導(dǎo)對含有不同區(qū)域片段pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌株生長的影響 共構(gòu)建了含有TM、CD、CT1、CT2、CT3片段

17、的原核表達載體，觀察細(xì)菌生長曲線變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化含有CT1段載體的細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌生長完全受到抑制，轉(zhuǎn)化含有CD段載體的細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌生長部分受到抑制，而IPTG誘導(dǎo)對轉(zhuǎn)化含有TM、CT2、CT3段載體細(xì)菌的生長沒有影響。 結(jié)論： 1.TLR9胞外段LRR2、LRR5、LRR8、LRR11序列中，最有可能是CpG DNA結(jié)合位點的是LRR11序列，但不排除LRR2聯(lián)合參與的可能性。 1)原核表達L