模擬微重力及延胡索乙素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251MG凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是最常見的嚴(yán)重危害人類健康的顱內(nèi)腫瘤之一。由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，多與腦組織無(wú)明顯分界，手術(shù)難以全切，故術(shù)后復(fù)發(fā)率高，生存率低；而常用抗腫瘤藥物對(duì)機(jī)體損害大、毒副作用強(qiáng)；且腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果[1]。所以，研究治療腦惡性膠質(zhì)瘤的方法和藥物已成為腦惡性膠質(zhì)瘤治療中的熱點(diǎn)問(wèn)題[2]。研究證實(shí)，藥物治療腦惡性膠質(zhì)瘤主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，探討治療方法和藥物對(duì)腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡的影響，具有重要的意義。

2、　　隨著對(duì)中藥治療惡性膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究不斷展開，中藥抗惡性膠質(zhì)瘤的作用已被證實(shí)[8]。作為中醫(yī)氣機(jī)升降理論中的重要組成部分，中藥通過(guò)升降的不同特性發(fā)揮著治療腫瘤的作用[9]。于是，我們以導(dǎo)師王宗仁教授臨床實(shí)踐為基礎(chǔ)，結(jié)合古代醫(yī)案中篩選出治療腦腫瘤的出現(xiàn)頻次最高的中藥，觀其抗惡性膠質(zhì)瘤的作用效果，為進(jìn)一步研發(fā)治療惡性膠質(zhì)瘤的中藥提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　隨著航天生命科學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，失重或模擬微重力能夠減慢細(xì)胞生長(zhǎng)、影響其周期

3、、促進(jìn)其凋亡，而惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有增值快、細(xì)胞周期失控和坑凋亡等特性。因此，我們選用模擬微重力這一“升提”作用類似的手段對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 MG進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期，以及細(xì)胞凋亡的影響。
　　第一部分基于中醫(yī)古籍挖掘的治療腦腫瘤高頻藥物分析
　　目的：篩選古代醫(yī)籍中，即具有升降作用，又具有抗腦腫瘤作用的高頻藥物。
　　方法：應(yīng)用文本發(fā)掘的方法，收集整理古代治療腦腫瘤的醫(yī)籍，提取醫(yī)案；運(yùn)用Micro

4、soft Access軟件建立古代腦腫瘤病醫(yī)案的數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件和頻數(shù)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)治療腦腫瘤的高頻藥物進(jìn)行挖掘分析，篩選出治療腦腫瘤的高頻藥物。
　　結(jié)果：在343份古籍醫(yī)案中，共記錄143味中藥，高頻藥物集中在前32味，其中以累積頻率達(dá)77.53％。其中，具升調(diào)作用的中藥有11個(gè)，占整個(gè)高頻藥物群的34.37%。頻次最高的為具有升提作用的中藥延胡索。
　　結(jié)論：具有升提作用的延胡索是篩選出的治療腦腫瘤頻

5、次最高的中藥。
　　第二部分 dl-THP抗惡性膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一 dl-THP對(duì)U251MG凋亡及p53和p21表達(dá)的影響
　　目的：觀察不同濃度的dl-THP對(duì)U251MG凋亡以及p53和下游p21表達(dá)的影響。
　　方法：用不同濃度的dl-THP干預(yù)U251MG，采用CCK-8法檢測(cè)U251MG增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；選用蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白p53、p21的表

6、達(dá)，同時(shí)，采用p53抑制劑PFT-α與dl-THP聯(lián)合處理U251MG，觀察U251MG增殖和凋亡。
　　結(jié)果：(1)不同濃度的 dl-THP干預(yù) U251MG后，U251MG的增殖均明顯受到抑制(P<0.01)，并呈濃度依賴性；(2)U251MG凋亡率隨干預(yù)濃度的升高而增加(P<0.01)；(3) U251MG中 p53和p21的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，PFT-α與dl-THP聯(lián)合處理U251MG后，U251MG的增殖和凋亡被

7、抑制。
　　結(jié)論：dl-THP能在體外抑制U251MG的增殖，并促進(jìn)凋亡，其促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能與p53被激活及其下游的p21生成及穩(wěn)定表達(dá)有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)二dl-THP對(duì)U251MG荷瘤裸鼠的抑瘤作用及p53和p21表達(dá)的影響
　　目的：觀察dl-THP對(duì)U251MG荷瘤裸鼠抗惡性膠質(zhì)瘤作用及對(duì)p53和p21蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：將U251MG種植于BALB/C-nu裸鼠皮下，建立U251MG荷瘤裸鼠模型。

8、連續(xù)給予dl-THP（1mg/Kg/day，2mg/Kg/day）10d后，剝離瘤體，稱重、測(cè)量體積、計(jì)算抑瘤率，并觀察模型小鼠生存時(shí)間；采用免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)dl-THP治療后瘤體組織內(nèi) p53和p21蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)dl-THP干預(yù)組的抑瘤率分別為54.2%（dl-THP1mg/Kg/day）和65.9％（dl-THP2mg/Kg/day），與對(duì)照組相比具有顯著的差異性(P<0.01)；(2)dl

9、-THP干預(yù)組最長(zhǎng)生存時(shí)間為34d；(3)瘤體組織內(nèi)的p53和p21的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。
　　結(jié)論： dl-THP能明顯抑制瘤組織增長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，其作用機(jī)制可能與瘤體組織內(nèi)的p53和p21蛋白表達(dá)上調(diào)促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第三部分模擬微重力對(duì)U251MG凋亡及p21和IGFBP-2表達(dá)的影響
　　目的：觀察模擬微重力對(duì)U251MG的增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響及促凋亡的機(jī)制。方法：在

10、模擬微重力干預(yù)U251MG12h、24h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測(cè)增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；透射電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡；采用熒光玻片蛋白芯片篩選與凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子，并選用蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)模擬微重力對(duì)凋亡相關(guān)蛋白IGFBP-2和p21蛋白及mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)模擬微重力干預(yù)12h、24h、48h、72h后，U251MG的增殖明顯受到抑制(P<0.01)

11、，并具有時(shí)間依賴性；(2)U251MG的細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變(P<0.01)，且隨模擬微重力干預(yù)時(shí)間的增加，逐漸由 S期阻滯漸向 G0/G1期阻滯轉(zhuǎn)變；(3) U251MG凋亡數(shù)量增加(P<0.01)，凋亡率隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.01)，并出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變；(4)U251MG中 p21的蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)，相反，IGFBP-2的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。
　　結(jié)論：模擬微重力能抑制U251MG增殖、阻滯其細(xì)