NF-κB-HIF-1alpha途徑與非霍奇金淋巴瘤放射敏感性的研究.pdf

1、背景：我國惡性淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤為主,約占85％,多數(shù)進展較快,呈廣泛跳躍式擴散,是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。放療是早期低中度非霍奇金淋巴瘤的主要治療方法之一,10年生存率約為55％-76％,復(fù)發(fā)率較高。中晚期的低中度腫瘤和中高度惡性腫瘤則需聯(lián)合化療或?qū)嵤┮曰煘橹鞯闹委煼桨?5年無復(fù)發(fā)生存率僅為50％左右。電離輻射能夠引起腫瘤細胞致命性損傷而死亡,然而由于內(nèi)在敏感性的不同,腫瘤細胞通過利用乏氧、細胞周期失控、凋亡信號通路異

2、常調(diào)節(jié)等方式產(chǎn)生放射抗拒現(xiàn)象,降低放射治療效果。因此開創(chuàng)嶄新的靶點治療途徑、增加腫瘤細胞對射線的敏感性,提高局部控制率和無復(fù)發(fā)生存率成為非霍奇金淋巴瘤臨床治療的一個重點課題。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下被廣泛誘導(dǎo)、產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子,大多數(shù)正常人類組織中未檢測到HIF-1α表達,但是大多數(shù)人類腫瘤中存在HIF-1α過表達,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1α過表達是腫瘤向惡性表型進展以及對放化療產(chǎn)生

3、抗性和耐藥性的基礎(chǔ)。因此,抑制HIF-1α蛋白表達,可有效地增加腫瘤細胞放化療的敏感性。
　　 目的：本研究首先明確淋巴瘤細胞和正常人B淋巴細胞中NF-κB和HIF-1α表達水平以及電離輻射對其表達的影響;其次,檢測常氧狀態(tài)下淋巴瘤細胞中survivin的表達水平,利用特異性抑制劑EC和反義轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒的方法確定HIF-1α對survivin的調(diào)控作用,利用NF-κB特異性抑制劑明確其對HIF-1α-survivin的調(diào)節(jié)

4、;最后,觀察特異性抑制劑EC和siRNA沉默HIF-1α對電離輻射誘導(dǎo)的淋巴瘤凋亡的放射增敏作用,并探討survivin等凋亡抑制基因在其中的作用。
　　 方法：
　　 1、常氧狀態(tài)下培養(yǎng)Namalwa、Ramos和Raji3種人非霍奇金淋巴瘤細胞系采用Western blot方法檢測細胞中P-65和HIF-1α蛋白的表達;利用X線輻射裝置進行照射,劑量為5Gy,采用Western blot方法,于照射后1h、4h、10

5、h和20h檢測腫瘤細胞中P65和HIF-1α蛋白的表達水平,探討電離輻射下NF-κB和HIF-1α之間可能存在的調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　 2、以HIF-1α特異性抑制劑EC預(yù)處理淋巴瘤細胞系,采用Western blot方法檢測0.2nM、2nM和10nM的EC對各細胞系中survivin蛋白表達的影響;將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染至淋巴瘤細胞中,采用Western blot方法檢測其對HIF-1α蛋白的抑制作用,同時觀察轉(zhuǎn)染后surv

6、ivin蛋白的表達水平改變;通過這兩種方法,確定常氧狀態(tài)下HIF-1α對survivin的調(diào)控作用。進而利用NF-κB特異性抑制劑QNz抑制腫瘤細胞中NF-κ3的表達,Western blot/RT-PCR方法利用觀察1、10、50nM QNZ對HIF-1α蛋白和mRNA表達水平的影響以及10nM QNZ對HIF-2α和HIF-1β蛋白表達的影響。在電離輻射條件下,應(yīng)用上述濃度的QNZ作用于3種淋巴瘤細胞,檢測作用后HIF-1α蛋白和m

7、RNA表達水平的改變。
　　 3、MTT法檢測單純照射、EC2nM以及二者聯(lián)合作用后24h、48h和72h后細胞增殖情況；經(jīng)0.2nM、2nM和10nM的EC預(yù)處理3種淋巴瘤細胞,5Gy電離輻射后,采用FACScan流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比；同法檢測反義轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后淋巴瘤細胞經(jīng)電離輻射后的凋亡指數(shù)；之后均檢測survivin蛋白以及Bcl-2,Bax和caspase-3的蛋白表達水平。
　　 4、所

8、有數(shù)據(jù)用3次獨立實驗的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。應(yīng)用SPSS11.0軟件進行t檢驗,P＜0.05認(rèn)定為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、Western blot結(jié)果顯示,在常氧狀態(tài)下在淋巴瘤Namalwa、Ramos、Raji細胞中均存在P-P65、HIF-1α蛋白的過度表達;Western blot結(jié)果顯示,照射后10h出現(xiàn)細胞核P-P65蛋白表達增加,至20h時表達開始下降,Namalwa組的P-P65蛋白在10

9、h與0h時的表達水平為0.45±0.05和0.10±0.02(t=11.25,P＜0.01)；Ramos組為0.69±0.06和0.08±0.01(t=17.43,P＜0.01)；而Raji組為0.68±0.04和0.11±0.02(t=22.09,P＜0.01)；照射前NF-κB上游調(diào)節(jié)分子IKK在各細胞株均有表達,照射后4h開始IKK蛋白表達即開始增加,與0h時相比,Namalwa組為0.49±0.05 vs0.22±0.03(t=

10、8.01,P＜0.01)；Ramos組為0.28±0.03 vs0.16±0.03(t=5.14,P＜0.01)；而Raji組為0.21±0.02 vs0.14±0.01,(t=5.42,P＜0.01)；3種淋巴瘤細胞株中的HIF-1α蛋白表達水平于增加照射后10～20h方才出現(xiàn)顯著增加,Namalwa組HIF-1α蛋白表達10h與0h相比為11.02±1.00 vs0.21±0.02(t=19.05,P＜0.01),Ramos組20h

11、與0h相比為12.8±1.59 vs0.38±0.03(t=12.44,P＜0.01)；Raji組10h與0h相比為4.56±0.33 vs1.65±0.21(t=12.88,P＜0.01)。
　　 2、Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用0、0.2、2和10nmol/LEC處理72h后,Namalwa細胞中survivin蛋白表達水平分別為1.72±0.11、0.46±0.06、0.41±0.08、0.24±0.06,Ram

12、os細胞分別為1.22±0.25、0.83±0.16、0.31±0.06、0.26±0.04,Paji細胞則為2.05±0.18、0.82±0.09、0.71±0.18、0.11±0.01。Namalwa、Ramos、Raji細胞轉(zhuǎn)染vector組survivin蛋白表達水平分別為0.51±0.05,0.59±0.10和0.62±07；而轉(zhuǎn)染siRNA組則為0.12±0.01,0.21±0.03和0.17±0.02。作為特異性抑制劑,Q

13、yZ可抑制三種非霍奇金淋巴瘤細胞P-p65蛋白表達水平；雖然對HIF-2α、HIF-1β蛋白表達無明顯影響,但是能夠顯著下調(diào)HIF-1α蛋白表達水平,0nM、1nM、10nM、50nM的QNZ作用12h后,Namalwa細胞中HIF-1α蛋白表達水平分別為3.08±0.57、0.30±0.04、0.26±0.01、0.16±0.05,Ramos細胞分別為1.14±0.25、0.28±0.08、0.27±0.04、0.17±0.03,Ra

14、ji細胞分別為0.86±0.06、0.83±0.03、0.56±0.10、0.18±0.05,用藥組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),且隨藥物濃度增加其作用更為明顯；應(yīng)用QNZ后三種淋巴瘤細胞HIF-1α mRNA均不同程度減低,其作用呈濃度依賴性；在3種細胞株中,NF-κ3抑制劑均使電離輻射后活化的HIF-1α蛋白表達下降,Namalwa組應(yīng)用QNZ1nM與單純照射時相比為1.05±0.15vs6.28±0.53(t=1

15、7.24,P＜0.01)；QNZ10nM為0.56±0.05 vs6.28±0.53(t=18.62,P＜0.01)；QNZ50hM為0.55±0.03 vs6.28±0.53(t=18.69,P＜0.01)。Ramos組應(yīng)用QNZ1nM與單純照射組相比為0.85±0.12 vs3.27±0.26(t=14.67,P＜0.01)；QNz10nM為0.36±0.04 vs3.27±0.26(t=19.14,P＜0.01):QNz50nM為

16、0.33±0.04vs3.27±0.26(t=19.35,P＜0.01)。Raji組應(yīng)用QNZ1nM與單純照射組相比為2.39±0.27 vs4.41±0.45(t=6.67,P＜0.01)；QNZ10nM為1.96±0.11 vs4.41±0.45(t=9.18,P＜0.01)；QNZ50nM為1.16±0.09 vs4.41±0.45(t=12.26,P＜0.01)。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,且隨藥物濃度的增加,這種改變更為明顯。

17、　　 3、MTT法檢測結(jié)果提示照射與用藥聯(lián)合應(yīng)用較單純用藥和單純照射明顯抑制了細胞增殖;應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示經(jīng)EC處理后人淋巴瘤細胞Namalwa、Ramos、Raji照射后凋亡較單純照射組明顯增加(P＜0.05),且具有藥物濃度依賴性;Namalwa細胞轉(zhuǎn)染vector與vector+RI和siRNA與siRNA+RI后凋亡細胞百分比分別10.53±2.24、15.32±3.64和6.72±0.96、20.2±1.8

18、7,Ramos細胞分別為8.87±1.13、15.05±2.46和7.09±0.63、21.02±3.12,Raji細胞分別為7.36±0.57、10.9±1.65和7.96±1.3、17.26±0.69；Namalwa細胞中空白對照組、單純照射組、EC0.2 nmol/L+RI組、EC2nmol/L+RI組、EC10nmol/L+RI組的survivin蛋白水平分別為0.35±0.039、1.4±0.11、0.85±0.14、0.59

19、±0.06、0.27±0.08,Ramos細胞分別為0.4±0.06、2.33±0.3、1.54±0.18、0.47±0.05、0.2±0.04,Raji細胞分別為0.72±0.1、3.64±0.81、3.53±0.89、0.36±0.01、0.12±0.04;Namalwa細胞轉(zhuǎn)染vector和vector+RI與siRNA和siRNA+RI組survivin蛋白表達分別為0.33±0.05、0.54±0.09、0.03±0.01和0

20、.04±0.01,Ramos細胞分別為0.48±0.03、1.27±0.12、0.11±0.03和0.07±0.01,Raji細胞分別為0.04±0.00、1.2±0.20、0.09±0.01和0.11±0.02；在3種淋巴瘤細胞株中,經(jīng)EC預(yù)處理后促凋亡Bax蛋白表達較單純照射組增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表達較單純照射組減少。凋亡直接相關(guān)因子cleaved-caspase-3蛋白表達較單純照射組明顯增加；HIF-1α siRNA組照

21、射后cleaved-caspase-3蛋白表達明顯增加而vector組無明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 1、淋巴瘤中存在NF-κB,HIF-1α和survivin的過度表達。
　　 2、淋巴瘤中存在NF-κB/HIF-1α/survivin調(diào)節(jié)途徑。
　　 3、電離輻射能夠誘導(dǎo)NF-κB,HIF-1α和survivin的過表達。
　　 4、抑制淋巴瘤細胞中的HIF-1α能夠產(chǎn)生放射增敏效應(yīng),其機理