MicroRNA-148b促進放射誘導(dǎo)的凋亡增強非霍奇金淋巴瘤細胞的放射敏感性.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是一組起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織的異質(zhì)性惡性腫瘤，根據(jù)其細胞來源分為B細胞型、T細胞型或NK細胞型。非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率在過去的四十年里明顯增長，1970年至1990年間幾乎翻倍。放射治療是非霍奇金淋巴瘤的主要治療手段之一。然而，約20％的疾病存在放射抗拒。因此，發(fā)展新的藥物來降低放射抗拒，增強這些疾病的放射敏感性是非常重要的。
　　MicroRNAs(miR

2、NAs)是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，長約20-22個核苷酸。miRNA結(jié)合到其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)位點，根據(jù)二者序列互補性抑制基因表達或降解靶基因。值得注意的是，越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與調(diào)控細胞的放射敏感性。因此，miRNA可作為提高腫瘤放療效果的新靶點。本研究的目的是探討miRNA在調(diào)控非霍奇金淋巴瘤放射敏感性中的作用。
　　為了尋找調(diào)控非霍奇金淋

3、巴瘤放射敏感性的miRNA，我們利用miRNA芯片檢測非霍奇金淋巴瘤細胞株Raji細胞照射前后miRNA的表達差異。用集落形成實驗檢測Raji細胞的放射敏感性，發(fā)現(xiàn)臨床常用的分割劑量2 Gy可以導(dǎo)致約50%的生長抑制。因此，給予Raji細胞2 Gy照射。照射后4小時提取RNA用miRNA芯片進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以P值<0.05為標準，20個miRNA照射后有差異表達，其中10個上調(diào)，10個下調(diào)。生物信息學分析表明，這些miRNA可能參與

4、放射敏感性的調(diào)控。
　　在差異表達的miRNA中，miR-148b在照射后表達上調(diào)1.53倍。為了驗證miR-148b照射后表達上調(diào)，使用非霍奇金淋巴瘤細胞株Raji細胞和RL細胞，在不同照射劑量和照射后時間點，通過熒光定量RT-PCR檢測未照射組和照射組細胞中miR-148b表達水平的差異。結(jié)果表明，與未照射組細胞相比，照射組細胞中的miR-148b表達顯著上調(diào)，與芯片的結(jié)果一致。
　　由于miR-148b照射后表達上調(diào)，

5、我們假設(shè)其參與放射敏感性的調(diào)控。使用瞬時轉(zhuǎn)染，我們利用miR-148b模擬劑(mimic)上調(diào)Raji細胞中miR-148b的表達，miR-148b抑制劑(inhibitor)下調(diào)Raji細胞中miRNA的表達。利用熒光顯微鏡，我們發(fā)現(xiàn)miRNA片段能夠成功轉(zhuǎn)染進入Raji細胞，轉(zhuǎn)染效率＞80%。進一步用實時定量RT-PCR驗證了miR-148b的上調(diào)和下調(diào)改變。
　　我們首先評估沒有照射時，miR-148B在體外對Raji細胞生

6、長的潛在影響。細胞增殖檢測表明，miR-148b上調(diào)的Raji細胞同對照組相比，細胞生長速度明顯降低。另一方面，miR-148b下調(diào)的Raji細胞細胞生長速度明顯增加。接下來，我們將轉(zhuǎn)染后的細胞進行照射。細胞增殖檢測表明，照射2Gy或4Gy后，miR-148b上調(diào)組和對照組同未照射時相比，Raji細胞死亡增加。然而，miR-148b上調(diào)照射組同對照照射組相比，細胞死亡明顯增加。這些結(jié)果支持假設(shè)，即miR-148b上調(diào)增加了Raji細胞的

7、放射敏感性。為進一步證實miR-148b對放射敏感性的調(diào)控作用，我們使用miR-148b抑制劑，觀察其能否誘導(dǎo)Raji細胞的放射抵抗。正如所預(yù)期的，我們發(fā)現(xiàn)miR-148b下調(diào)組同對照組相比，明顯地對放射抗拒。這些結(jié)果表明，miR-148b對Raji細胞的放射敏感性有重要的調(diào)控作用。
　　為了進一步證實miR-148b可以增強Raji細胞的放射敏感性，我們進行了集落形成實驗，并獲得了類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-148b模擬劑的Raji

8、細胞同對照組相比，照射后集落形成能力明顯降低。相反地，轉(zhuǎn)染miR-148b抑制劑的Raji細胞明顯對放射抗拒。這些結(jié)果提供了進一步的證據(jù)表明，miR-148b增加了Raji細胞的放射敏感性。
　　接下來，我們探討miR-148b對放射敏感性的影響是否是由于細胞周期的改變。流式細胞儀分析表明，miR-148b模擬劑和抑制劑不影響Raji細胞的細胞周期。轉(zhuǎn)染24小時后，給予細胞0Gy、2Gy和4Gy的X射線照射，24 h后再進行分析。

9、Raji細胞照射后表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性G2/M期阻滯。然而，同對照組相比，miR-148b模擬劑和抑制劑對Raji細胞照射后的細胞周期沒有影響。
　　凋亡是惡性腫瘤細胞死亡的重要機制。我們探討miR-148b是否通過誘導(dǎo)凋亡增強Raji細胞的放射敏感性。Raji細胞轉(zhuǎn)染miR-148b模擬劑和抑制劑后，培養(yǎng)24小時，然后接受不同劑量的照射（0 Gy、2Gy和4Gy），24小時后進行Annexin V/PI雙染色及流式細胞儀分析。

10、未轉(zhuǎn)染細胞也在照射后24小時分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在照射0 Gy、2Gy和4Gy時，miR-148b高表達組的凋亡細胞比例均明顯比對照組和未轉(zhuǎn)染組高(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，miR-148b可以促進放射誘導(dǎo)的Raji細胞凋亡。
　　生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-w可能是miR-148b的靶基因。進一步的研究表明，miR-148b可以抑制Raji細胞中Bcl-w基因mRNA和蛋白的表達。Bcl-w蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡

11、蛋白的重要一員，而Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮極為重要的調(diào)控作用。由此，我們提出假說，miR-148b抑制Bcl-w的表達，通過激活線粒體凋亡途徑增強非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此假說有待進一步驗證。
　　綜上所述，我們的結(jié)果表明，miR-148b促進放射誘導(dǎo)的凋亡增強非霍奇金淋巴瘤細胞的放射敏感性。miR-148b可以被用來預(yù)測非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此外，改變miR-148b的表達可能是一種很有前途的治療方案。