吡那地爾、美托洛爾、谷氨酰胺、胰島素四藥聯(lián)用對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：研究吡那地爾（pinacidil，Pin）、美托洛爾（metoprolol，Met）、谷氨酰胺（glutamine，Glu）、胰島素（insulin，Ins）四藥聯(lián)用對(duì)缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）所致大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：將培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為7組，即（1）正常對(duì)照（Con）組；（2）缺氧/復(fù)氧（H/R）組；（3）吡那地爾（Pin

2、）組；（4）美托洛爾（Met）組；（5）谷氨酰胺（Glu）組；（6）胰島素（Ins）組；（7）吡那地爾、美托洛爾、谷氨酰胺和胰島素四藥聯(lián)用（PMGI）組。正常對(duì)照組換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；H/R組缺氧培養(yǎng)180 min，復(fù)氧150 min；其余各組則在缺氧前加入相應(yīng)的藥物預(yù)處理30 min，Pin、Met、Glu和Ins的終濃度分別為1×10-6 mol/L，2×10-5 mol/L，8x10-3 mol/L，0.01 U/L。

3、測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞的存活率；收集培養(yǎng)液測(cè)定乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）活性，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；羅丹明123（Rhodamine123，Rh123）熒光探針標(biāo)記線粒體，檢測(cè)熒光強(qiáng)度以反映心肌細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，△ψm）變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡百分率；Western印跡法檢測(cè)心

4、肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)性蛋白HSP70的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞存活率：與Con組比較，H/R組的細(xì)胞存活率明顯減小，從96.0±4.0％降低到48.3.±10.3％（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的細(xì)胞存活率明顯升高72.5±5.4％，71.2±5.2％，70.2±5.5％，68.4±10.8％，84.5±5.8％vs48.3.±10.3％（P<0.01），

5、與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的細(xì)胞存活率明顯升高，P<0.01，與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 2.LDH活性：與Con組比較，H/R組的LDH活性明顯升高，從584.1±17.0 U/L升高到834.8±25.4 U/L（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的LDH活性明顯降低637.8±25.4 U/L

6、，656.3±21.8 U/L，667.5±26.5 U/L，703.0±36.6 U/L，597.0±12.7 U/L vs834.8±25.4 U/L（P<0.01），與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的LDH活性明顯降低，P<0.01，與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 3.總SOD和Mn-SOD活性：與Con組比較，H/R組的總SOD活性明顯降低

7、，從53.44±1.22 U/ml降低到35.90±1.64 U/ml（P<0.01），Mn-SOD活性也明顯降低，從20.22±1.47 U/ml降低到12.66±0.54 U/ml（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的總SOD活性明顯升高50.02±3.76 U/ml，44.45±4.83 U/ml，48.38±3.87 U/ml，42.39±2.30 U/ml，53.19±1.57 U/ml

8、 vs35.90±1.64 U/ml（P<0.01），Mn-SOD活性明顯也升高18.02±2.17 U/ml，15.24±1.87 U/ml，17.34±1.69 U/ml，14.19±1.08 U/ml，19.78±1.49 U/ml vs12.66±0.54 U/ml（P<0.01），與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的總SOD和Mn-SOD活性升高，P<0.05，與Co

9、n組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 4.△ψm：與Con組比較，H/R組的細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度明顯減小，從248712±12377降低到153851±5498（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的線粒體熒光強(qiáng)度明顯升高190514±10428，160514±7784，166656±6150，169384±7696，224103±11731 vs153851±5498（P<0.05）

10、，與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度明顯升高，P<0.01，與Con組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 5.細(xì)胞凋亡率：與Con組比較，H/R組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，其凋亡率從0.11±0.03％增加到10.95±1.82％（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的細(xì)胞凋亡率明顯降低2.85±0.19％，6

11、.83±0.92％，3.47±0.53％，4.90±0.70％，1.44±0.11％vs10.95±1.82％（P<0.01）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。
　　 6.熱休克蛋白70：與Con組比較，H/R組的HSP70表達(dá)明顯增多，其條帶光密度值從10.2±1.2增加到20.7±2.1（P<0.01）；與H/R組相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI組的HSP

12、70表達(dá)明顯升高42.2±4.7，43.2±4.9，56.8±5.2,44.1±3.9，71.7±6.3 vs20.7±2.1（P<0.01）；與Pin、Met、Glu、Ins組相比，PMGI組的HSP70表達(dá)明顯升高（P<0.01）。
　　 結(jié)論：對(duì)于缺氧/復(fù)氧損傷的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，吡那地爾、美托洛爾、谷氨酰胺與胰島素四藥聯(lián)用組與藥物單用組相比能明顯提高細(xì)胞存活率，保護(hù)其細(xì)胞膜，減少LDH滲漏；增加抗氧化能力，提高SOD